Lezione 5 Fisiologia generale

Come è stato dimostrato il rapporto di scambio 3:2 per la pompa Na+/K+?

Esperimento sui globuli rossi umani

Le cellule vengono inizialmente incubate per 9 giorni a

2°C. Le basse temperature rallentano enormemente

l’attività delle pompe, infatti si riscontra un blocco

della pompa Na+/K+.

In questo modo vanno avanti solo i processi passivi: il

sodio intracellulare aumenta e il potassio si riduce. I

due ioni, muovendosi passivamente, raggiungono

l’equilibrio con la composizione dell’ambiente

extracellulare, che è caratterizzata da un’alta [Na+] e

una bassa [K+].

In alto si vede il livello di sodio (cerchi), in basso il

livello di potassio (triangoli).

Lo 0 nel grafico corrisponde alla fine dei 9 giorni (quelli

sono i livelli di ioni quando il globulo rosso è rimasto a

2 °C per quel periodo di tempo).

Si riportano le cellule a 37°C (temperatura fisiologica)

del sangue: l’andamento delle concentrazioni è in

funzione delle ore trascorse a 37°C.

L’esperimento viene fatto mettendo i globuli rossi in due diverse soluzioni:

- Mezzo privo di K (linee tratteggiate con figure vuote)

Anche con un aumento della temperatura, le [Na+] e [K+] rimangono costanti nel tempo

- Soluzione 21mM di KCl

La concentrazione di sodio diminuisce, mentre quella di potassio aumenta. Queste variazioni

avvengono a velocità diversa, come indicato dalla pendenza delle due rette.

La velocità con cui diminuisce il sodio (pendenza negativa dei cerchi pieni) è maggiore della velocità

con cui la concentrazione con cui il potassio aumenta all’interno della cellula.

Il rapporto di queste due pendenze è 1,5=3/2. Il numero di ioni Na+ trasportati all’esterno della

cellula è 1,5 volte maggiore del numero di ioni K+ trasportati all’interno della cellula dalla pompa.

Poiché non si possono trasportare frazioni di ioni il numero minimo che garantisce questo rapporto di 1,5 è

3/2.

Poiché 2 cariche positive sono portate all’interno e 3 cariche positive sono espulse si ha un eccesso di

cariche positive in uscita. Si dice che la pompa è elettrogenica.

Conclusioni:

- il rapporto fra gli ioni Na+ trasportati all’esterno e gli ioni K+ trasportati all’interno è 3/2:

deducibile dalle linee nere.

- il trasporto è un trasporto accoppiato. La pompa sodio-potassio è in grado di funzionare solo se

nell’ambiente esterno è presente potassio: deducibile dalle linee tratteggiate, i cui punti si

mantengono alla stessa quota.

Questo significa che il trasporto del sodio è sempre accoppiato con il trasporto del potassio, e in

assenza di uno dei due ioni la pompa si arresta.

Il meccanismo di azione

Modello Post-Albers

La pompa esiste in due stati distinti E1 ed E2, nei quali ha differente affinità per gli ioni Na+ e K+:

Lo stato E1 ha un’elevata affinità per il sodio e viene fosforilato in seguito al legame con 3 ioni sodio,

passando allo stato E1-P.

In questa configurazione la molecola passa spontaneamente te allo stato E2-P, che ha una bassa affinità

per il sodio, che viene rilasciato all’esterno, e un’elevata affinità per il potassio, che invece si lega alla

pompa.

Questo legame determina una defosforilazione della proteina, che passa allo stato E2.

Da qui ritorna nello stato E1 in maniera spontanea e libera il potassio all’interno della cellula.

Il trasporto transmembranario avviene:

- durante le transizioni E1-P→E2-P per Na+

- durante le transizioni E2→E1 per K+

Il sodio viene liberato all’esterno e il potassio all’interno della cellula.

Le modifiche strutturali

Essendo un ciclo si può partire da qualsiasi punto. Noi partiremo dalla configurazione E1.

FIGURA E1:

- Il dominio T presenta un varco per l’ingresso degli ioni Na+ dal lato citoplasmatico. Vi si trovano dei

siti di legame che hanno in questa configurazione un’elevata affinità per il sodio (nella figura il

sodio è rappresentato da una X) 2+

- Il dominio N ha un’elevata affinità per l’ATP, che si lega al sito catalitico sottoforma di Mg -ATP, (in

questo modo il magnesio può bilanciare le cariche negative del γ-fosfato) rendendo possibile la

formazione di un legame fra sito N e sito P.

FIGURA E1-P:

Si passa dallo stato E1 allo stato E1-P.

- In un movimento di chiusura, attraverso

una modifica conformazionale, viene

contemporaneamente fosforilato il

residuo di aspartato presente sul sito P.

- La fosforilazione determina l’occlusione

degli ioni sodio, che rimangono

intrappolati all’interno del dominio T.

- La nuova posizione reciproca di N, P e T

provoca una prima rotazione del

dominio A, con cui cambiano i rapporti

col dominio P.

In pratica si generano delle tensioni fra il

dominio A e la regione transmembranaria T, che

determinano un’ulteriore rotazione di A.

FIGURA E2-P:

Da E1-P si passa allo stato E2-P, in cui l’ADP

viene liberato nel citosol.

- La rotazione del dominio A, promuovendo queste tensioni al livello dei segmenti M1, M2 M3

transmembranari determina un cambiamento dell’affinità dei siti presenti all’interno del dominio T.

In pratica diminuisce l’affinità di T per il sodio e aumenta l’affinità per il potassio.

- Si viene a determinare un varco verso l’ambiente extracellulare, attraverso cui gli ioni sodio

fuoriescono e attraverso cui invece entrano gli ioni potassio.

- La rotazione di A, inoltre, fa entrare in contatto la porzione indicata in E1-P come TGE (tirosina,

glicina, glutammato, i tre amminoacidi presenti) con l’aspartato fosforilato presente sul sito P.

- Il legame del potassio con T determina un’ulteriore rotazione di A, che esercita la sua azione

fosfatasica riducendo la forza del legame a idrogeno fra Mg2+ e aspartato e permettendo l’ingresso

di una molecola di acqua, che provoca l’idrolisi del legame del fosfato con l’aspartato.

Questo processo di rotazione di a nel dominio fosfatasico è il processo più lento di tutto il trasporto, per cui

è il processo “rate limiting”.

FIGURA E2:

A questo punto si ha la transizione dallo stato E2-P allo stato E2.

- Il fosfato e il magnesio vengono liberati nel citoplasma: questa liberazione è associata al ripristino

della posizione di N e P in linea col dominio T.

- Nel passaggio allo stato E2 il varco all’esterno per il potassio si chiude e quest’ultimo rimane

occluso all’interno del dominio T.

- Il dominio A, in seguito alla liberazione del fosfato e del magnesio, ritorna nella posizione iniziale

- Anche il sito N si allontana dal sito P per repulsione elettrostatica.

La molecola ritorna così allo stato E1, in cui si riapre il varco verso il citosol. Perciò, siccome nella

configurazione E1 l’affinità per il potassio è bassa, il potassio viene liberato all’interno della cellula e il sodio

può rientrare così da far ricominciare il ciclo.

In pratica quando si ha il legame col potassio si promuove la transizione da E2-P a E2.

Esperimento dell’assone di seppia

- Perché l’assone di seppia?

È un preparato facilmente reperibile e maneggevole.

Viene posto in una vaschetta in cui è presente una soluzione arricchita con Na+ radioattivo per un po’ di

tempo. In questo modo l’assone viene caricato da ioni sodio marcati, e quindi tracciabili.

Dopo questo trattamento l’assone viene messo in una vaschetta sperimentale e questa è costituita da una

bacinella collegata a una pompa in ingresso e a una pompa in uscita da cui viene fatta affluire acqua di

mare mantenuta a un livello costante proprio grazie a queste due pompe.

L’assone viene fatto passare attraverso un tubo capillare a forma di T, che è collegato in alto con una

siringa. in modo che si possano prelevare dei campioni di liquido extracellulare attraverso una siringa.

La necessità di usare un capillare deriva dal fatto che la quantità di ioni Na+ che fuoriescono è

relativamente piccola, e se venissero dispersi nella soluzione presente nella bacinella sarebbe difficile

rilevarne la radioattività. In questo modo le quantità che vengono prelevate sono molto piccole e a partire

da un ambiente extracellulare molto limitato.

Viene misurata la radioattività a tempi prefissati per poter rilevare l’eventuale fuoriuscita di sodio marcato

dall’interno della cellula, e quindi valutare se esiste o meno il trasporto attivo.

Le caratteristiche del trasporto attivo sono state studiate utilizzando manovre diverse per mettere in

evidenza la sensibilità della pompa a bloccanti del metabolismo, ad esempio alla temperatura, a farmaci e

alla concentrazione extracellulare di potassio (la cui assenza impedisce alla pompa di funzionare

correttamente.

Vediamo alcuni risultati di questi esperimenti.

In entrambi i grafici viene evidenziata la natura contro gradiente del trasporto di sodio.

Quando si è misurato l’efflusso del sodio radioattivo dall’assone di seppia si è visto che questo ha un valore

diverso da 0, quindi il sodio viene espulso dalla cellula contro il proprio gradiente elettrochimico, poiché il

potenziale negativo intracellulare e la bassa concentrazione intracellulare di sodio determinano un ingresso

passivo di sodio.

a) Figura a destra

Se si aggiunge DNP (di-nitrofenolo) alla soluzione extracellulare si assiste ad un blocco della natura

attiva del processo di trasporto, che utilizza energia metabolica. Ciò è comprensibile sapendo che il

DNP blocca la produzione di ATP nella fosforilazione ossidativa. Infatti si evidenzia un arresto della

fuoriuscita di sodio all’assone (curva decrescente). Si dimostra così che il trasporto necessita di

energia metabolica.

b) Figura a sinistra

Si blocca il trasporto aggiungendo CN, il quale blocca il metabolismo. Se una determinata quantità

di ATP viene fornita in un istante preciso, in presenza di cianuro, si osserva che il trasporto viene

ripristinato e la pompa comincia di nuovo a funzionare, fino a che l’ATP iniettata non è stata

completamente idrolizzata dalla ATPasi.

L’iniezione di una quantità maggiore di ATP mostra un maggiore ripristino dell’attività della pompa

e un tempo più lungo affinché questo ripristino dell’attività della pompa decada.

Con questi due esperimenti si dimostra che il trasporto necessita di energia metabolica.

Altri esperimenti sulla pompa Na+/K+

Vediamo le caratteristiche del trasporto attivo studiate nell’assone di seppia approfondendole

ulteriormente, ponendo particolare attenzione alla concentrazione extracellulare di potassio, di farmaci

come l’ouabaina (estratta dallo stròfanto)