Genetica I - Appunti

LINKAGE TRA UN CARATTERE E UN MARCATORE POLIMORFICO

Si tratta dell'associazione o concatenazione tra un carattere e un marcatore polimorfico sul DNA. Questo processo ha permesso in passato del clonaggio di geni malattia come la fibrosi cistica. Sul DNA erano i marcatori polimorfici a guidare gli scienziati sul gene.

Nell'esempio possiamo vedere il carattere del colore degli occhi nei MendAlieni. Gli occhi neri sono OO o Oo mentre gli occhi arancio sono oo. O e o sono le varianti alleliche.

Il marcatore polimorfico può essere uno Short Tandem Repeat (STR) che è una breve ripetizione in tandem di una breve sequenza nucleotidica. Diversi cromosomi in diversi individui possono portare un numero diverso di queste ripetizioni e vengono messi in evidenza con la PCR. Nell'esempio la PCR è effettuata con primer cioè le frecce rosse che amplificano esponenzialmente un tratto di DNA compreso tra i due primer. Il tratto di DNA viene migrato in un

gelelettroforetico dando origine a una banda. Ciò avviene perché gli acidi nucleici sono carichi negativamente e posti in un campo elettrico tendono a muoversi verso il polo positivo. I frammenti saranno rallentati nella loro corsa in misura inversamente proporzionale al logaritmo del loro peso molecolare. Nell'esempio abbiamo due varianti dell'STR di cui una con 6 ripetizioni e l'altra con 10. Da queste avremo tre diversi genotipi possibili: un individuo che porta la variante con 6 ripetizioni su entrambi i cromosomi sarà omozigote 6, 6 (solo una banda per 6 ripetizioni), un individuo omozigote 10, 10 per le 10 ripetizioni (solo una banda per 10 ripetizioni) e un individuo eterozigote 6, 10 che porta la variante con 6 ripetizioni su un cromosoma e la variante con 10 sull'altro (due bande, una su 6 e una su 10). Esistono altri marcatori polimorfi per il DNA come il Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ovvero il polimorfismo di restrizione.

Comporta la presenza o assenza di un sito di riconoscimento per un endonucleasi di restrizione, un enzima di restrizione. Questi riconoscono e tagliano il DNA delle sequenze specifiche, producendo un taglio su entrambe le eliche. Basta solo che si modifichi un nucleotide affinché la sequenza non venga più riconosciuta dall'endonucleasi di restrizione. RFLP sono messi in evidenza mediante digestione con quel enzima di restrizione che taglia un tipo di cromosoma ma non taglia un altro. Inoltre ci sono anche i Single Nucleotide Polymorphism (SNP) che si distinguono in quanto polimorfismi del singolo nucleotide. Su un cromosoma abbiamo una sequenza che varia da quella di un altro cromosoma per un singolo nucleotide. Gli SNP vengono messi in evidenza con il sequenziamento oppure con la PCR (perfect match con il primer uguale alla sequenza ma non con quello col diverso nucleotide).

Facciamo un incrocio simile a quelli di Mendel tra una linea pura omozigote dominante con occhi neri (OO) e 10, 10 per...

più sono vicini il gene per il colore degli occhi e il polimorfismo STR. Più sono lontani, più i ricombinanti si presentano. Più sono vicini più, i ricombinanti sono rari. Inizialmente quindi gli scienziati andarono a cercare polimorfismi a livello del DNA che segregassero insieme al carattere malattia e poi dopo furono ricercati dei ricombinanti relativi all’associazione allelica iniziale. Ad esempio se in fasi successive sia venuto l’avvicinamento a dove sta il gene CF che mutato in omozigosi determina la fibrosi cistica. CF codifica una proteina transmembrana che se mutata affligge gli epiteli polmonare, intestinale e seminifero. La fibrosi cistica è una malattia recessiva perché è una mutazione perdita di funzione. Allora si è andati a cercare tratti di DNA che hanno dei polimorfismi evidenziabili come STR o RFLP. Definiamo come APLOTIPO una variante allelica della sequenza del DNA ad esempio presenza o assenza di un

certo sito direstrizione. Poi fu seguita la segregazione del carattere fibrosi cistica insieme a polimorfismi direstrizione sul cromosoma 7. Fare lo studio traparentali e ricombinanti aveva portato allacreazione di una mappa genetica della regione del gene CF. Già si sapeva dove mappavano ipolimorfismi, ma non il gene CF, finchè fu stabilitache si trovava a 15 cM dal marcatore polimorfico DOCRI e a 0,4 cM dal marcatore polimorfico METe 0,3 cM dal marcatore polimorfico J 3-11.

Vediamo come la malattia può essere associata a un determinato aplotipo. Nella tabella in fondo alla figura a destra vediamo come è stata studiata per diverse popolazioni l’associazione del fenotipo fibrosi cistica con degli aplotipi in corrispondenza di due loci (marcatori) del DNA: XV2C e KM 19.

Nella popolazione britannica troviamo tanti affetti da fibrosi cistica e tanti senza e questi individui sono stati tipizzati riguardo al loro aplotipo in corrispondenza dei due marcatori precedenti.

Bisogna analizzare i rarissimiricombinanti. Si inizia stabilendo il genotipo nei vari loci polimorfici che sono concatenati alla fibrosi cistica. Con il cerchio e il quadrato definiamo due alleli a una singola posizione che è la posizione del marcatore (met H, XV2C, KM 19, J 3-11). Segregano diverse varianti a tutte e quattro le posizioni del DNA. Si vede nei soggetti malati con quale combinazione di varianti alleliche segrega la fibrosicistica nella famiglia. Quindi si confrontano gli aplotipi nei figli affetti e nei genitori. Il figlio 2-1 porta alle quattro diverse posizioni dei marcatori i seguenti alleli: eterozigote, omozigote, omozigote e eterozigote. I due genitori devono essere per forza portatori sani. L'altro figlio malato 2-2 porta lo stesso cromosoma del fratello: ▪▪●●. Mentre i fratelli sani non hanno questo cromosoma ○□□○. I figli 2-1 e 2-2 hanno acquisito il cromosoma malato dal padre. La femmina 2-3 ha ereditato i cromosomi sani per entrambi i.

Può avvenire un crossing-over o ricombinazione. La probabilità del crossing-over è definita dalla distanza tra i geni. Rivedendo l'esempio fatto in precedenza è più probabile la ricombinazione tra scute e forked che tra scute ed echinus per le distanze che li collegano. Studiando questo cromosoma dopo tante generazioni vediamo come i geni lontani verosimilmente prima o poi avranno ricombinato, mentre i geni vicini non avranno ricombinato (con la stessa frequenza). Vediamo nell'esempio a sinistra come il grado di rimescolamento dipende dalla vicinanza tra i geni. Se B2 e E2 C2 sono molto vicini, anche con il passare delle generazioni tenderanno a rimanere associati. I geni B e C non ricombinano praticamente mai tra di loro; solo dopo moltissime generazioni troveremo una certa frequenza di ricombinanti.