Concetti di Biologia molecolare

Regolazione trascrizione negli eucarioti

I regolatori degli eucarioti usano domini differenti per il legame al DNA, ma il riconoscimento del DNA si basa sugli stessi principi dei batteri.

Le proteine regolatrici eucariotiche si legano spesso come dimeri mediante un'elica di riconoscimento nel solco maggiore.

In altre proteine regolatrici invece il sito di riconoscimento si presenta con domini caratterizzati da strutture diverse. Un esempio sono gli eterodimeri, con il vantaggio di riconoscere un maggior numero di siti. Un altro esempio sono i monomeri.

Un altro esempio sono le proteine con omeodominio che consiste di 3 alfa-eliche di cui 2 formano l'elica-giro-elica, la terza elica è quella di riconoscimento al DNA, le altre eliche possono formare motivi addizionali di riconoscimento. Un altro esempio sono i domini contenenti atomi di zinco (zinc cluster o zinc finger, a dita di zinco), motivi detti a cerniera di leucine, motivi elica-ansa-elica (HLH). Con questi motivi, i

regolatori si legano al DNA.-I motivi con cui i regolatori si legano alla polimerasi, cioè le regioni di attivazione, non sono strutture ben definite: eliche, residui acidi, idrofobici, piccole unità ripetute che funzionano solo quando messe assieme, residui di glutammina, di prolina.

In generale si è visto che le regioni con caratteristiche acide sono dei forti attivatori.

Non c'è interazione diretta tra l'attivatore e la polimerasi, ma gli attivatori reclutano il complesso del Mediatore, il TFIID (legami cooperativi), modificatori dei nucleosomi. I modificatori dei nucleosomi sono le acetiltransferasi e quelli che rimuovono o rimodellano i nucleosomi, con riferimento ai Bromo-domini e alla maggior accessibilità di tratti del DNA quando sono fuori dall'ottamero istonico.

Gli isolatori controllano l'azione degli attivatori quando posti fra un enhancer e il promotore, inibiscono l'attivazione di quel gene da parte di

quell'enhancer. - L'enhancer è inteso come elemento ampificatore, che è un tratto del DNA lontano o vicino a monteo valle del gene controllato e che si lega a proteine afavore della trascrizione. - Quindi gli isolatori bloccano l'attivazione promossa dagli enhancer. - Attivatori più enhacer=enhanceosoma. - I repressori negli eucarioti possono: legarsi alla polimerasi già legata al dna e bloccarla; interferire con l'azione degli attivatori; reclutare istone deacetilasi (sileziamento genico). - I corepressori e coattivatori sono tutte quelle proteine ausiliarie che non sono direttamentecoinvolte nella trascrizione ma che ottimizzano la reazione ditrascrizione. - Il silenziamento genico o trascrizionale è un effetto di posizione e dipende dalla localizzazionefisica del gene dentro il cromosoma. Si può diffondere sulunghi tratti di DNA. Non dipende da alcun segnale specifico dell'ambiente. - La più comune forma di silenziamento

è quella associata alla eterocromatina (telomeri e centromeri): sperimentalmente se un tratto viene spostato da una regione eu- a una eterocromatica, si spegne.

Il silenziamento nei mammiferi è legato alla metilazione del DNA che inibisce il legame di proteine specifiche o fa riconoscere tale DNA metilato ai repressori che spegneranno poi i geni vicini portandovi le istone deacetilasi.

Il silenziamento è comunque limitato a telomeri e centromeri grazie agli isolatori.

La metilazione dei dna nei mammiferi è legata all'imprinting: quando si ereditano due cromosomi, uno materno e l'altro paterno, uno dei due è metilato imprintato così da essere spento e permettere al gene corrispondente nell'altro cromosoma di esprimersi da solo.

La regolazione epigenetica sta nell'ereditarietà di un piano di espressione, anche nelle cellule di generazioni successive, anche se il segnale scatenante che ha dato inizio a quel piano di espressione

Era presente solo nella cellula madre o comunque per un piccolo lasso di tempo.

LA REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE NEI PROCARIOTI

Prima di tutto i geni nella loro espressione sono spesso controllati da segnali extracellulari, che sono molecole presenti nel mezzo di crescita. Questi segnali in vari modi entrano nella cellula fino ad arrivare ai geni, attraverso proteine regolatrici repressori o attivatori, che legano il DNA in modo specifico. Ovviamente un attivatore aumenta la trascrizione del gene considerato regolato e un repressore la rallenta o abolisce. Quali passaggi sono inibiti e quali attivati dipende dal promotore e dalle proteine regolatrici coinvolte. La maggior parte delle proteine agisce a livello dell'inizio della trascrizione: perché fa sì che non venga sprecata energia o materiale per iniziare a sintetizzare mRNA inutile e perché è più facile controllare una sequenza di DNA piuttosto che tanti mRNA. Tuttavia non tutta la regolazione è

Incentrata sull'inizio così da poter modulare meglio il segnale o più segnali insieme e per poter ridurre il tempo totale di risposta. Partiamo quindi dalla regolazione dell'inizio della trascrizione.

In assenza di proteine regolatrici, la polimerasi si lega debolmente ai promotori, ma quando si lega inizia la trascrizione e questo porta ad un basso livello di espressione costitutiva detto livello basale: il passaggio limitante è il legame con la polimerasi.

Se invece ci sono le proteine regolatrici: un repressore si lega all'operone che è il sito del dna a cui si lega e che si sovrappone al promotore così che la polimerasi non si può legare al promotore; un attivatore si lega vicino al promotore e interagisce con la polimerasi portandola sul dna. Questo meccanismo con cui funziona l'attivatore è detto reclutamento o legame cooperativo.

Il resto avviene tutto spontaneamente. Ne sono un esempio i geni lac di E. coli (vedi nella

sezesempi).Un altro passaggio limitante può essere la trasformazione da complesso chiuso ad aperto ( e non illegame della polimerasi al dna).In questo caso l'attivatore agisce attraverso l'allosteria provocando un cambiamentoconformazionale al dna o alla polimerasi.Un altro passaggio limitante è l'evasione dal promotore. I repressori possono interagire con la polimerasie inibire la transizione a complesso aperto o la clearance trattenendo la polimerasi sul promotore.Inoltre le sequenze regolatrici a cui le proteine regolatrici si legano possono anche essere lontanodal promotore, allora avremo un attivazionea distanza con la formazione di anse nel dna per avvicinare i vari siti, esistono a tal propositoproteine "architettoniche" che inducono la curvatura del dna.Inoltre più regolatori insieme possono in modo cooperativo svolgere le loro funzioni; inoltre iregolatori possono essere a loro voltaregolati da segnali specifici e avere così2 conformazioni, funzionante o no, attivate dall'allosteria con le molecole segnale.

ESEMPI

Esempio del legame cooperativo o reclutamento: geni lac di E. coli.

I tre geni lac sono lac Y (codifica la permeasi del lattosio), lac Z (codifica la beta galattosidasi per lascissione del lattosio), lacA (codifica un enzima che libera la cellula dai prodotti tiogalattosidi tossici che possono entrare assieme al lattosio dalla permeasi).

Questi 3 geni insieme formano un operone e si tratta di un messaggio policistronico perché l'mrna risutante conterrà i tre geni.

Questi geni sono espressi solo in presenza di lattosio e in assenza di glucosio. Sono regolati da una proteina attivatrice CAP e dal repressore LAC. Il repressore deve reprimere i geni quando il lattosio manca. Cap attiva i geni quando il glucosio manca, significa che dobbiamo trarre energia dal lattosio e ci servono i suoi geni.

Il repressore LAC impedisce fisicamente alla polimerasi di legarsi al promotore.

Riguarda la CAP, in sua assenza la polimerasi si lega ma in modo debole perché ha la sequenza -35 non ottimale. CAP si lega come dimero al DNA e alla polimerasi e agisce così con il reclutamento o legame cooperativo (la regione di CAP che è in contatto con la coda CTD della polimerasi è detta regione attivatrice). CAP e LAC si legano entrambi come dimeri al DNA: ogni monomero lega una metà di una sequenza ripetitiva invertita, la loro struttura secondaria è elica-giro-elica e sono ovviamente legami sequenza-specifici; nota che LAC è un tetramero ma si lega ad ogni operatore come dimero; nota che CAP introduce una curvatura nel DNA che si avvolge parzialmente alla proteina. L'integrazione dei segnali si ha quando i geni sono controllati da più segnali: esempio dei geni lac di E. coli in cui due segnali (lattosio e glucosio) lavorano sulla loro espressione. Il controllo combinatorio si ha quando una proteina regolatrice agisce su vari geni diversi: es.

diCAP in coli.