Citologia - la membrana cellulare

ALTERAZIONE DEL CAMPO ELETTRICO E DELLA CONCENTRAZIONE IONICA; RICONOSCIMENTO CELLULARE

Quando un carboidrato viene aggiunto come gruppo idrofilico alla sfingosina (da cui derivano gli sfingolipidi, classe principale dei lipidi di membrana, oltre a fosfolipidi e colesterolo) si forma un GLICOLIPIDE.

‼️ L'acido sialico svolge diverse funzioni, in particolare come recettore di membrana, per esempio, per le molecole di adesione cellulare e per i virus influenzali. Inoltre, trattiene le molecole di acqua sulla superficie delle membrane contribuendo al mantenimento della fluidità del muco. In diagnostica, è utilizzato come marker dei tumori epiteliali. L'acido sialico ricopre anche le cellule tumorali e svolge una funzione fondamentale per la cellula tumorale, permettendole di eludere il sistema immunitario, quindi, di resistere alle nostre

I "LIPID RAFT" o zattere lipidiche, sono aree specializzate della membrana in cui sono concentrati sfingolipidi, colesterolo e proteine. Gli sfingolipidi grazie alle loro catene idrocarburiche lunghe creano forze attrattive maggiori, favorendo la formazione di microdomini. I lipid raft aiutano a concentrare proteine per facilitare diverse funzioni, come il trasporto in vescicole o la trasmissione di segnali. Nei lipid raft i due monostrati sono comunicanti tra loro.

LE PROTEINE DI MEMBRANA

Esse sono proteine che si trovano nel mezzo del doppio strato fosfolipidico. Le quantità e tipi di proteine in una membrana sono altamente variabili e possono avere diverse funzioni (permettere passaggio di ioni o molecole, funzione di recettore). Le cellule possono confinare proteine e lipidi in domini specifici della membrana. Nelle cellule epiteliali una distribuzione asimmetrica di proteine è spesso essenziale per la funzione dell'epitelio stesso.

–(giunzioni guardo fondo)Le proteine di membrana possono essere di tre tipi:

• INTEGRALI: utili come recettori, canali, trasportatori di ioni o soluti, possono trasferire elettroni. Instaurano relazioni con il doppio strato attraverso le forze di Wan Der Waals. Sono proteine di transmembrana e attraversano α. a foglietto βlo strato in forma elica. Possono assumere anche struttura (barili beta), formando canali transmembrana data la loro forma a tubo. Una proteina può assumere entrambe le forme in tratti diversi. Proteine con forma beta-barile sono le PORINE, diverse proteine che formano pori (restringibili) e attraversano il doppio strato lipidico come un barile. ACQUAPORINE: permettono il passaggio di acqua. Vi sono diversi tipi di tali proteine:
• MONOTIPICA
• MONOPASSO (attraversa tutta la membrana)
• MULTIPASSO (più proteine monopasso)
• A SUBUNITÀ MULTIPLA (coppie di proteine monopasso)
• PERIFERICHE: legate da legami non covalenti a proteine integrali.

Possono trovarsi sul lato fosfolipidico extracellulare. Agiscono come enzimi e trasmettitori di segnali. - LEGATE AI LIPIDI: legate covalentemente a tutti e due i lati del doppio strato fosfolipidico. Sono legate sulfoglietto esterno della membrana attaccandosi ad un fosfolipide, mediante un'oligosaccaride. Sono legate sul latocitosolico attaccandosi ad un singolo acido grasso. Vi sono due tipi di tali proteine: ▪ ACIDO GRASSO O ANCORA PRENILICA (lato intracellulare) ▪ ACNCORA GPI (glicosilfosfatidilinositolo) (lato extracellulare) FUNZIONE DELLE PROTEINE DI MEMBRANA: - TRASPORTO di ioni o molecole (canale idrofilo selettivo e proteine pompa); - TRASDUZIONE DEL SEGNALE: il legame con il ligando induce nella proteina transmembrana un cambio di conformazione; - RICONOSCIMENTO TRA CELLULE; - ADESIONE INTRACELLULARE; - ADESIONE AL CITOSCHELETRO E ALLA MATRICE EXTRACELLULARE. DIFFUSIONE DELLE PROTEINE DI MEMBRANA Le proteine di membrana non passano attraverso il doppio strato (flip-flop fosfolipidi),ma possono ruotare (diffusione rotazionale) o muoversi lateralmente (diffusione laterale) nella membrana o flettersi (flessione). Proteine che intervengono nello spostamento flip-flop dei fosfolipidi: - PROTEINE FLIPPASI: trasportano i fosfolipidi dal foglietto esoplasmatico (lume) a quello citoplasmatico. - PROTEINE FLOPPASI: trasportano i fosfolipidi dal foglietto endoplasmatico a quello esoplasmatico. Enzimi proteici che mobilitano i lipidi della membrana: - FLOPPASI SELETTIVE: mantengono la maggior parte di colesterolo, PC ed SM nel foglietto esoplasmatico; - FLIPPASI SELETTIVE: mantengono la maggior parte di PS, PE e PI nel foglietto endoplasmatico; - SCRAMBLASI: interrompono brevemente l'asimmetria di membrana muovendo a caso i fosfolipidi (PL). * SONO TUTTI FOSFOLIPIDI: PC = osfatidilcolina; SM = sfingomielina; PE = fosfatidiletanolammina; PI = fosfatidilinositolo; PS = fosfatidilserina; PG = fosfatidilglicerolo; DPG = difosfatidilglicerolo (cardiolipina). GIUNZIONI, molecole di

adesione E CELLULE EPITELIALI

Lo scopo delle giunzioni (proteine di membrana fisse) è quello di avvicinare due cellule adiacenti dalla regione apicale e possono essere:

• STRETTE (complessi proteici che stringono e occludono la membrana occludenti): impediscono il passaggio dei fluidi tra le cellule andando a formare, attorno al perimetro cellulare, una cintura continua detta zonula;
• ADERENTI (con filamenti di actina e caderina): fungono da supporto strutturale ai tessuti, si trovano ad esempio in tessuto muscolare e epidermide;
• COMUNICANTI (Gap Junction, formano connessioni): si trovano ad esempio nel tessuto connettivo, consentono passaggio di molecole e ioni tra le due cellule;
• DESMOSOMI (con filamenti di cheratina e caderina): formano una placca di adesione costituita da un addensamento di materiale proteico citoplasmatico.

Le molecole di adesione sono proteine collocate sulla membrana cellulare che formano, come le giunzioni, un legame con altre cellule o con la matrice extracellulare.

Chiamate anche CAM sono principalmente recettori transmembrana (selectine,integrine e caderine). Il tessuto epiteliale è uno dei 4 tessuti fondamentali degli animali ed è composto da epidermide (strato più esterno) e derma (strato più interno). L'epidermide si ancora al derma tramite delle giunzioni connettive. Le cellule epiteliali presentano pochissima matrice extracellulare e sono connesse da giunzioni che garantiscono al tessuto epiteliale una notevole resistenza. Le cellule epiteliali vengono dette POLARIZZATE poiché si presentano divise in due porzioni (poli) differenti: DOMINIO BASOLATERALE (superficie basale) e DOMINIO APICALE/LUMINALE (superficie apico-laterale).

DOMINIO BASOLATERALE: rivolto verso la membrana basale, verso l'interno della cellula.

DOMINIO APICALE: rivolto verso l'esterno, ossia il LUME dell'organo o lo spazio extracorporeo, per epiteli di Può mostrare strutture particolari che rispecchiano le

funzioni dell'epitelio di appartenenza: rivestimento esterno delle cellule (ciglia e microvilli).

STUDIO DELLE PROTEINE DI MEMBRANA ATTRAVERSO LA MEMBRANA DEI GLOBULI ROSSI

Poiché dispongono di:

• Grande disponibilità;
• Non hanno nucleo o organelli;

Sfrutto i "fantasmi" dei globuli rossi (GHOST: globulo rosso rotto dopo essere stato posto in soluzione ipotonica).

Procedimento:

1. Prelievo del sangue;
2. Individuo i globuli rossi;
3. Immergo i globuli rossi in soluzione ipotonica;
4. I globuli rossi si riempiono di acqua per fare eguagliare le concentrazioni (osmosi);
5. I globuli passano dalla forma disco biconcava ad una forma sferica;
6. Si riempiono di acqua fino a scoppiare e rompersi, dando origine ad un GHOST di globulo rosso;
7. Sfrutto detergenti per separare le proteine dalla membrana: DENATURAZIONE DELLE PROTEINE.

DETERGENTI IONICI E NON IONICI: agenti denaturanti delle proteine che permettono lo studio isolato di esse.

Rottura membrana plasmatica e formazione di

micella (di struttura morfologicamente uguale ai fosfolipidi) che si legano ai fosfolipidi o alle proteine nella regione idrofobica. Per studiare alcuni complessi proteici (come pompa sodio-potassio) vengono usati dei detergenti BLANDI (isolati frammenti fosfolipidi e proteine). Traiton X100: detergente che fa forellini nelle membrane delle cellule permettendo l'ingresso di altre sostanze (colorante o anticorpo). Sodio-dodecil-solfato (detergente ionico). Applico ELETTROFORESI: tecnica che sfrutta un passaggio di corrente. Utile (in questo caso) tramite tecnica WESTERN BLOT, a separare delle proteine della membrana del ghost del globulo rosso, per poterle individuare e l'utilizzo di un gel classificare. Tale tecnica sfrutta che presenta pori di diverse dimensioni permettendo il passaggio solo a strutture con un determinato diametro (setaccio). Studiando poi la velocità con cui diverse proteine trapassano i pori del gel, è possibile individuare il peso di ogni tipo di proteina.

proteina presente nella membrana. Poi, in base all'intensità con cui trapassano il gel, è possibile scoprire anche la quantità stimata, di ogni tipo di proteina presente, all'interno della membrana cellulare.

SPESSORE BANDA = MAGGIORE QUANTITÀ DI PROTEINA

VELOCITÀ CON CUI TRAPASSANO IL GEL = PESO

Il Wester Blot termina con una reazione che si chiama IMMUNOBLOTTING (per riconoscere il tipo specifico di proteina): la striscia di gel elettroforetica viene passata e trasferita, per passaggio elettrico, su un foglio di cellulosa/membrana porosa che viene poi trattato con un anticorpo specifico, a seconda della tipologia di proteina che voglio individuare.

STUDIO DELLE PROTEINE DI MEMBRANA ATTRAVERSO FREEZE FRACTURE ELECTRON MICROSCOPY (FFEM).

• Cellule congelate
• Inserita punta sottilissima nel doppio strato (tra i due strati fosfolipidici) che separa i due strati
• Posso individuare le proteine integrali che rimangono attaccate a uno dei due

versanti.

DIFFERENZA DI CONCENTRAZIONE DI UNA SOSTANZA - OSMOSI

SOLUZIONE IPOTONICA: poca concentrazione di una sostanza in un ambiente, rispetto all'altro ambiente (esterno o interno ad essa);

SOLUZIONE IPERTONICA: alta concentrazione di una sostanza (esterno o interno ad essa);

SOLUZIONE ISOTONICA: i due ambienti presentano la stessa concentrazione di una determinata sostanza.

Se pongo la cellula in un ambiente ipotonico (rispetto alla concentrazione della sostanza all'interno della cellula), la cellula si riempirà d'acqua per diluire la sua concentrazione a quella dell'ambiente esterno e farla eguagliare essa. La cellula esplode.

Se pongo la cellula in un ambiente ipertonico (rispetto alla concentrazione della sostanza all'interno della cellula), la cellula farà fuoriuscire acqua per eguagliare la concentrazione dei due ambienti (esterno ed interno ad essa). La cellula raggrinzisce.