Biologia cellulare con laboratorio

AMBIENTE DI COLTURA – MEZZO DI COLTURA

Nella passata lezione abbiamo parlato dell’ambiente di coltura, e in particolare abbiamo analizzato in

maniera molto estesa i substrati su cui è possibile effettuare una coltura di cellule eucarioti.

Oggi ci occuperemo di comprendere quali sono i possibili mezzi di coltura, e quali devono essere le

caratteristiche fondamentali per effettuare una coltura cellulare dei mezzi di coltura stessi.

È chiaro che tutti i mezzi di coltura, cioè le soluzioni che vengono in contatto con la coltura cellulare

eucariotica, devono essere soluzioni sterili, e devono fornire alle cellule in coltura tutte le molecole

necessarie per la sopravvivenza e per la proliferazione cellulare, sia nutrienti, quindi amminoacidi,

nucleotidi e zuccheri, sia oligoelementi, che fattori di crescita, per indurre la proliferazione.

Normalmente, i terreni di coltura e le soluzioni saline bilanciate vengono comprate dalle aziende che

ne garantiscono la sterilità e le caratteristiche chimico-fisiche.

In primo luogo, si può operare una divisione macroscopica fra soluzioni saline bilanciate e terreni

definiti.

Con le prime vengono forniti sali e acqua alla coltura cellulare. Devono essere isotoniche con le

cellule e avere un adeguato sistema tampone. Non si tratta di terreni in cui le cellule possono essere

incubate per periodi lunghi, poiché non contengono sostanze nutritive.

I secondi sono terreni veri e propri, nei quali le cellule vengono incubate. A seconda della

composizione in termini di amminoacidi, si possono distinguere terreni definiti semplici, che

contengono solo amminoacidi essenziali, e terreni definiti complessi, che contengono anche gli

amminoacidi non essenziali.

Soluzioni saline bilanciate (BSS Balanced Salt Solution)

Le BSS sono soluzioni costituite da sali inorganici, isotoniche con le cellule e che forniscono un

sistema tampone per mantenere il pH a livelli fisiologici (7.3-7.4).

Non sono dei veri e propri terreni di coltura, poiché non sono complete dal punto di vista nutritivo.

Per questo motivo, non vengono utilizzate per incubare le cellule, ma come diluenti, soluzioni di

lavaggio o di dissezione, oppure per incubazioni brevi. In questo ultimo caso, è necessario aggiungere

al mezzo del glucosio, una fonte di carbonio, che consentirà un tempo di incubazione massimo di 4

ore.

Ci sono essenzialmente due soluzioni saline bilanciate più utilizzate:

PBS (Phosphate Buffered Saline): soluzione salina bilanciata in cui si ha un tampone

● fosfato, a base di cloruro di sodio, sodio fosfato e potassio fosfato. Il tampone che garantisce

il mantenimento del pH a valori fisiologici, cioè 7.3-7.4 è il tampone fosfato, e la soluzione è

– ovviamente – isotonica con le cellule.

HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution): soluzione salina bilanciata basata su un tampone

● carbonato.

Segue una tabella con la composizione della PBS.

In basso, si osserva come in questo caso sia stato aggiunto glucosio e alcuni antibiotici per prevenire

la contaminazione.

Terreni definiti

Sono dei terreni di coltura nei quali le cellule vengono incubate durante la coltura cellulare.

Come già accennato, sulla base della loro composizione in termini di amminoacidi, i terreni definiti

possono essere classificati come semplici o complessi.

I terreni semplici contengono solo gli amminoacidi essenziali, mentre quelli complessi contengono

tutti gli amminoacidi, essenziali e non essenziali.

Un terreno di coltura devono garantire un corretto apporto di nutrienti (amminoacidi, nucleotidi,

zuccheri), di fattori di crescita e di oligoelementi, in modo da assicurare la sopravvivenza e la

proliferazione cellulare, devono essere isotonici con le cellule, quindi avere una pressione osmotica

identica a quella cellulare, e un devono avere un pH e una temperatura ottimali e costanti. Un pH

costante, come nel caso della soluzione salina bilanciata, sarà garantito da un sistema tampone.

In particolare, le cellule di animali a sangue caldo crescono di solito a una temperatura di 37°C (con

qualche eccezione) in un mezzo acquoso che abbia un tampone tale da mantenere un pH di 7.3-7.4.

In passato venivano utilizzati estratti naturali come terreni, come ad esempio coaguli di linfa, sangue

o estratti tissutali, mentre adesso i terreni utilizzati sono definiti nella loro composizione, e questo ha

la funzione di rendere il terreno standardizzato, e quindi creare delle condizioni ripetibili. Ciò fa sì

che esperimenti condotti in laboratori differenti possano essere effettuati nelle stesse identiche

condizioni.

Il primo terreno definito per cellule eucariotiche venne studiato e messo appunto da Harry Eagle nel

1955.

Composizione:

Sali inorganici

● Zuccheri

● Amminoacidi

● Vitamine

● Molecole organiche

● Minerali

● Basi azotate

● Antibiotici

● Siero

●

Seguono approfondimenti su questi costituenti.

Sali inorganici

Forniscono ioni necessari per il mantenimento del potenziale di membrana e dell’equilibrio osmotico,

+ 2+ 2+ + - 3- 42- 43-

fra cui Na , Mg , Ca , K , Cl , HCO , SO , PO . Hanno inoltre importanti funzioni come co-

fattori di enzimi, e un ruolo chiave nell’adesione. A questo proposito ricordiamo il ruolo del calcio

nei legami delle integrine alla matrice cellulare, nei legami cellula-cellula mediati da caderine, e nel

3

signaling. C’è un gradiente di calcio di circa 10 fra l’interno e l’esterno della cellula, per cui, quando

la membrana diventa permeabile al calcio a causa della segnalazione, si ha l’ingresso del calcio

all’interno della cellula, che determina dei cambiamenti nella trasduzione del segnale estremamente

rilevanti.

Lo ione solfato viene utilizzato per formare le molecole della matrice extracellulare.

Zuccheri

Generalmente viene utilizzato glucosio, che rappresenta la principale fonte sia di carbonio, per le

biosintesi, che energetica che viene fornita alle cellule in coltura. Le formulazioni dei terreni definiti

si distinguono sulla base della loro concentrazione di glucosio in low glucose (1 g/L) e high glucose

(4.5 g/L).

A seconda della tipologia di esperimenti che si vogliono effettuare, si prediligerà un terreno rispetto

a un altro.

Alcuni terreni possono contenere anche galattosio, fruttosio e maltosio.

Amminoacidi

Sono fondamentali per la sintesi proteica delle cellule in coltura. Gli amminoacidi essenziali, che

l’organismo non è in grado di sintetizzare, devono essere sempre aggiunti in coltura. Molto spesso si

utilizzano terreni definiti complessi, contenenti sia amminoacidi essenziali che non essenziali.

La glutamina (Gln) è particolarmente importante, perché è richiesta dalla maggior parte delle cellule,

in quanto rappresenta una fonte di azoto e viene spesso utilizzata anche come fonte di carbonio,

soprattutto dalle cellule che hanno un elevato ritmo proliferativo.

In generale, i terreni di coltura possono avere una concentrazione di Gln che varia tra 0.5 e 10 mM,

anche se la concentrazione di Gln più utilizzata è in un range fra i 2 e i 4 mM. Questo amminoacido

è instabile nel mezzo di coltura, con una vita media di 3-5 gg a 37°C e di circa 15 gg a 4°C. Ciò

significa che, dopo un certo periodo di tempo, la glutamina deve essere aggiunta nuovamente al

mezzo di coltura. Per la sua breve emivita, i terreni di coltura che sono stati comprati e mantenuti a

lungo a 4°C vengono addizionati con glutamina diluita in PBS poco prima dell’utilizzo.

Vitamine

Specialmente vengono utilizzate le vitamine del gruppo B, necessarie per la crescita e la

proliferazione poiché molto spesso funzionano da co-fattori. Per esempio, la tiamina pirofosfato, che

deriva dalla vitamina B1, viene utilizza