Biologia cellulare con laboratorio

Oggi parleremo di come organizzare la stanza dove allestiamo le colture cellulari. Abbiamo più volte

sottolineato l'importanza della sterilità quando si ha a che fare con delle colture cellulari e questo è dovuto al

fatto che i contaminanti, quindi microrganismi siano essi batteri, virus oppure funghi quindi sia i lieviti che

funghi e muffe, hanno ritmo proliferativo molto maggiore rispetto alle colture cellulari animali, in particolare

le cellule di mammifero o di umani che normalmente vengono coltivate. Avendo un ritmo proliferativo

maggiore, questi organismi competono e depauperano il terreno di nutrienti, quindi sottraggono nutrienti alle

colture cellulari e ovviamente, con le loro attività metaboliche, portano ad acidificazione del terreno di coltura,

quindi alterano anche le caratteristiche chimico-fisiche del terreno stesso. In taluni casi la contaminazione può

essere di per sé citotossica, cioè delle sostanze che sono tossiche per le cellule e quindi avere effetti citopatici

anche molto evidenti. In ogni caso, una coltura contaminata non è un modello rappresentativo di quello che

vogliamo studiare quindi le contaminazioni sono il principale rischio associato alle colture cellulari.

In questo schema vedete che sono organizzate le varie azioni che devono essere svolte quando si ha a che fare

con delle colture cellulari; in particolare le azioni importanti sono il lavaggio, la sterilizzazione, la preparazione,

la manipolazione delle colture cellulari, l'incubazione delle colture cellulari e la loro conservazione. Queste

attività che sono connesse all'utilizzo delle colture cellulari, nel caso in cui sia si abbia a disposizione un'unica

stanza, devono essere ben organizzate in modo da creare un gradiente di sterilità, cioè da una zona dove la

sterilità è minore a una zona in cui la sterilità deve essere massima. In particolare, la zona in cui vengono

manipolate le colture cellulari (rappresentato dal quadrato arancione, che rappresenta la cappa sterile a flusso

laminare), deve essere il più lontano possibile dalla porta, poiché i flussi d'aria che vengono dalla porta e dalle

finestre sono possibili fonti di contaminazione. Per cui, la cappa a flusso laminare dove vengono manipolate

le cellule deve essere il più lontana possibile sia da porte che da finestre; inoltre, l'area di lavaggio, che per la

presenza dell'acqua è sottoposta a contaminazione, dovrà essere dalla parte opposta rispetto alla cappa sterile a

flusso laminare, quindi più vicino alla porta.

Le due aree saranno separate da una zona in cui si ha la sterilizzazione: qui ad esempio è rappresentata con

un’autoclave e una stufa, che hanno lo scopo di sterilizzare materiali diversi.

Si frappone all'area di lavaggio e alla cappa sterile a flusso laminare un'area di preparazione, dove qui vedete

per esempio è presente una centrifuga, un banco di preparazione e un bagnetto d’acqua riscaldante. Vicino

all'area in cui si eseguono le manipolazioni delle colture cellulari, quindi vicino alla cappa a flusso laminare,

dovranno essere posti: l’incubatore (lo strumento che è deputato a tenere le colture nel tempo dopo averle

manipolate) e un'area in cui le colture verranno conservate: in particolare, qui vedete c'è un frigorifero -20 e

addirittura in questa stanza sono presenti il freezer, il crio-freezer e i dewar, cioè dei contenitori in cui è

presente azoto liquido e nei quali vengono conservate le cellule crio-conservate per tempi molto lunghi.

Quindi se tutte le azioni che abbiamo descritto vanno inserite in un'unica stanza è necessario creare un gradiente

di sterilità nella stanza, in cui le azioni più soggette a contaminazioni sono più spostate verso la porta e, via via

che ci si sposta verso la parete opposta rispetto a quella della porta, ci sono le azioni che necessitano di sterilità.

Come vedete vicino all'area in cui le colture vengono manipolate è anche presente un microscopio rovesciato a

contrasto di fase che permette l'osservazione, che è fondamentale per comprendere cosa sta succedendo alla

coltura.

Come abbiamo detto la manipolazione delle colture cellulari avviene esclusivamente in cappe sterili a flusso

laminare, le quali sono delle degli strumenti fondamentali per le colture cellulari poiché permettono di creare

un ambiente sterile in una stanza che ovviamente sterile non è. Quindi, le cappe a flusso laminare (e ce ne sono

di tipi diversi) sono fondamentali per creare un ambiente sterile in cui poter manipolare le colture cellulari,

prevenendo quindi la contaminazione.

Questi strumenti consentono di creare delle zone sterili in ambienti non sterili: all’interno della cappa sterile c'è

un controllo dell'aria, in particolare un controllo della contaminazione dell'aria: le cappe sono costruite in modo

tale da avere al loro interno aria sterile; questo non è sempre vero e ci sono vari tipologie di cappe.

In generale, la definizione di cappe a flusso laminare è quella di creare un ambiente sterile che consenta di

controllare la contaminazione dell'aria. Il flusso laminare è un flusso d'aria che è unidirezionale ed è formato

da filetti di aria paralleli che si muovono tutti alla stessa velocità in tutti i punti. In questo modo viene creata

una corrente d'aria che è omogenea e non ha turbolenze; quindi si ha un flusso d'aria unidirezionale e che si

muove alla stessa velocità in tutti i suoi punti. Questo flusso fornisce protezione dalla polvere e dalla

contaminazione, quindi il fatto di avere un flusso d'aria e unidirezionale quindi che si muove in un'unica

direzione e la cui velocità in tutti i punti è costante, crea una corrente omogenea e senza turbolenze e quindi

protegge dalla polvere e dalla contaminazione.

In molti casi, quindi in molti tipi di cappe, il flusso laminare è sterile: la sterilità del flusso laminare è dovuta al

suo passaggio attraverso filtri che sono deputati alla decontaminazione, quindi alla sterilizzazione dell'aria, che

si chiamano filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air filter). Quindi se il flusso laminare passa attraverso

un filtro HEPA, otterremo un flusso laminare di aria sterile.

I filtri HEPA sono dei filtri costituiti da un intreccio di microfibre di vetro che hanno la capacità di trattenere

il 99,99% di particelle che hanno diametro superiore a 0,1-0,3 μm; sono dimensioni molto più piccole rispetto

a quelle dei batteri e che, tuttavia, non comprendono i virus. Rappresentano comunque un buon modo di

contaminare l'aria; quindi il flusso laminare è un flusso unidirezionale costituito da filetti di aria paralleli che si

muovono alla stessa velocità in tutti i suoi punti. Il flusso laminare è sterile se l'aria viene filtrata attraverso filtri

HEPA, che per essere definiti tali devono avere le un'efficienza del 99,99% di trattenere particelle con diametro

superiore a 0,1 e 0,3 μm e la velocità del flusso laminare è di circa 0,45 m/s con un'incertezza del 20%. Se il

flusso laminare passa attraverso i filtri, si ottiene un fronte d'aria sterile che trascina lontano dalla zona di lavoro

qualsiasi contaminante, in modo tale che il piano dove si lavora della cappa a flusso laminare sia sterile.

Le cappe a flusso laminare si distinguono in due grandi gruppi, a seconda della direzione del flusso laminare:

cappe a flusso laminare orizzontale oppure cappe a flusso laminare verticale.

A) FLUSSO LAMINARE ORIZZONTALE:

In questa immagine è riportata una sezione di una cappa a flusso

laminare orizzontale, cioè il flusso laminare (che è indicato da

queste frecce) è parallelo all'area di lavoro; quindi l’aria nelle

cappe a flusso laminare orizzontale si muove in modo parallelo

al piano di lavoro, direzionata dalla parte posteriore della cappa

verso l'operatore.

Queste cappe hanno un filtro HEPA, rappresentato da questa

porzione posteriore alla cappa rosina con i rombi viola; quindi,

l'aria che investe l'area di lavoro viene prima filtrata da un filtro

HEPA per cui queste cappe consentono di lavorare in condizioni

di sterilità.

Tuttavia, non sono cappe di sicurezza biologica: una delle

caratteristiche fondamentali delle cappe a flusso laminare non è

solo quella di creare un ambiente sterile in cui poter manipolare

in sicurezza le colture cellulari, ma anche quella di fornire una

barriera di protezione sia per l'operatore che per l'ambiente

circostante. Il flusso laminare, oltre a garantire la sterilità del

campione, quindi garantire di lavorare in condizioni di sterilità,

ha anche la funzione di proteggere l'operatore e l’ambiente dai

possibili contaminanti presenti nella coltura cellulare e per questo vengono chiamate anche cappe di sicurezza

biologica. Le cappe a flusso laminare orizzontale non sono cappe di sicurezza biologica: questo è dovuto al fatto

che quest’aria che proviene dalla parte posteriore della cappa viene filtrata dal filtro HEPA prima di andare a

investire il campione; quindi, il campione si trova in una condizione di sterilità e può essere correttamente

manipolato, tuttavia a seguito del dell'interazione con il campione, l'aria non viene ulteriormente filtrata e

investe sia l'operatore che l'ambiente. Quindi, se nel campione ci fosse una eventuale contaminazione questa

non verrebbe rimossa poiché l'aria non viene filtrata a seguito dell'interazione con il campione e andrebbe a

investire sia all' operatore che l'ambiente. Per cui le cappe di sicurezza a flusso laminare orizzontale non sono

cappe di sicurezza biologica.

Questa tipologia di cappe viene usata principalmente per preparare i terreni di coltura, quindi non vengono

normalmente messe in questo tipo di cappa colture

cellulari che, attraverso la formazione di aerosol

(evento molto probabile quando si maneggiano le

cellule), potrebbero contaminare l'operatore e

l'ambiente. Quindi, vengono usate principalmente per

preparare i terreni di coltura o reagenti che siano sterili

e non tossici, quindi che non presentano delle possibili

contaminazioni o che non siano pericolose per

l'operatore.

B) FLUSSO LAMINARE VERTICALE:

Nei laboratori dove si eseguono colture cellulari

vengono più spesso utilizzate cappe a flusso laminare

verticale: sono caratterizzate da un flusso d'aria

verticale, cioè che proviene dalla parte superiore della

cappa e percorre la cappa in direzione perpendicolare

all'area di lavoro. In questa immagine vedete è

rappresentata una sezione di una cappa a flusso

laminare verticale con le frecce, che indicano il flusso laminare verticale, che sono perpendicolari all'area di

lavoro. Questa tipologia di cappe consente la protezione dell'operatore innanzitutto perché l'operatore non viene

investito dal flusso d'aria, che si muove soltanto all'interno della cappa; inoltre nella parte anteriore della cappa

è presente uno schermo di vetro la cui altezza può essere normalmente regolata e che pone una barriera tra

l'operatore che sta all'esterno e la manipolazione delle colture cellulari all'interno.

La manipolazione delle colture cellulari può essere effettuata grazie al fatto che nel fronte della cappa è presente

una porzione non coperta dallo schermo di vetro in cui possono essere introdotte le mani per manipolare le

cellule. In questo tipo di cappe il flusso laminare proviene dall'alto, quindi dalla porzione superiore della cappa

e investe il campione nell'area di lavoro. Il flusso viene poi aspirato da sotto il piano di lavoro forellinato;

quindi l’aria aspirata da sotto il piano può essere ricircolata all'interno della cappa oppure può essere espulsa

attraverso un sistema di espulsione che va all'esterno dell'edificio grazie alla presenza di filtri e a seconda della

posizione di questi, si possono avere diversi tipi di cappe a flusso laminare verticale. Queste sono cappe che

normalmente forniscono una protezione sia all'operatore che all'ambiente, per cui sono cappe di sicurezza

biologica; la sicurezza biologica e anche la sterilità del campione sono garantite se la cappa viene posizionata

in un punto adeguato della stanza (come abbiamo visto infatti se vengono poste vicino alle porte anche alle

finestre, le correnti d'aria possono perturbare il flusso rendendolo inefficace). Quindi sono cappe di sicurezza

biologica se sono correttamente posizionate all'interno della stanza.

Vediamo ora quali sono i tipi di cappe flusso laminare verticale a seconda di

come sono posizionati i filtri HEPA: si distinguono cappe a flusso laminare

verticale di classe I, di classe II e classe III.

Cappe di classe I: in immagine si ha la sezione della cappa a flusso laminare

● verticale di classe I e i filtri HEPA sono rappresentati da questa porzione a

zig zag; nella classe di cappe I l'aria viene introdotta all'interno della cappa

e investe il campione; dopo avere investito il campione viene filtrata e

ricircolata all'interno della cappa oppure espulsa. Quindi, queste cappe di

classe I garantiscono la protezione dell'operatore e dell'ambiente ma non

consentono la sterilità del campione, cioè non garantiscono la tenuta del

campione. Questo è dovuto al fatto che in entrata nelle cappe di classe I non

c'è un filtro, per cui l'aria che entra all'interno della dell'area di lavoro non è

aria sterile. Infatti nella porzione superiore della cappa non c'è un filtro

HEPA, per cui il flusso che investe il campione non è sterile e quindi non è

garantita la sterilità del campione. Questa tipologia di cappe non è molto

utilizzata nei laboratori di biologia cellulare perché non garantisce appunto

la sterilità delle colture cellulari.

Cappe di classe II: invece sono molto diffuse le cappe a

● flusso laminare verticale di classe II; in queste cappe,

schematizzate in figura a destra, in posizione (C) sono

presenti dei filtri HEPA: l’aria proviene dall'alto e, prima

di essere introdotta all'interno dell'area di lavoro, il flusso

viene filtrato da un filtro HEPA; quindi, l'aria che entra

all'interno dell'area di lavoro ed entra in contatto con il

campione di lavoro è sterile. Inoltre, a seguito

dell’interazione con il campione, l'aria viene ulteriormente

filtrata dal filtro che è posto sotto il piano di lavoro

forellinato in posizione (E); quindi a seguito di una

potenziale contaminazione da parte del campione, l'aria

viene ulteriormente filtrata. A questo punto l'aria viene o

ricircolata e ritorna all'inter