Biochimica metabolismo 2

Decarbossilazione ossidativa

Nella matrice mitocondriale

Una volta formato il piruvato dalla glicolisi deve essere convertito in acetil coenzima A prima di entrare nel ciclo di Krebs con la decarbossilazione ossidativa.

La piruvato deidrogenasi è l'enzima che prepara il substrato per il ciclo di Krebs. Il piruvato va ad essere decarbossilato (decarbossilazione ossidativa): c'è l'estrazione di due elettroni a dare NADH (quindi è una reazione di ossidoriduzione) e perché vi è il distacco di un atomo di carbonio (CO₂).

Questa reazione è relativamente semplice ma per avvenire ha bisogno di un complesso di 3 enzimi chiamato complesso della piruvato deidrogenasi. Questi hanno bisogno di uno dei reagenti che è il coenzima A, una grande molecola formata da un ADP fosforilato, pantotenato e mercapto etil amina (che ha il gruppo SH reattivo che forma il tioestere che, se viene rotto, libera una quantità di energia simile a quella che si libera quando si stacca il fosfato dall'ATP. Per questo motivo il coenzima A è un attivatore di acili, in questo caso di acetili).

Il piruvato viene decarbossilato (perde il C = O) e lega il gruppo carbonilico creando un legame tioestere (alta energia simile al legame fosfato dall’ATP). La conservazione dell'energia si trova nel CoA e nel trasferimento di 2e- da NAD a NADH.

Attività enzimatiche

• E1: piruvato deidrogenasi con cofattore TPP
• E2: diidrolipoil transacetilasi con lipoamide
• E3: diidrolipoil deidrogenasi con FAD

Ognuno di questi tre enzimi ha un cofattore stabile (un gruppo prostetico):

• Tiamina pirofosfato (TPP), un derivato della vitamina B1, è un trasportatore di gruppi aldeidici.
• L'acido lipoico con un ponte disolfuro ossidato è un trasportatore di gruppi acilici (acetilici in questo caso) che si legano a uno dei due zolfi.
• FAD che è stabilmente associata all’enzima E3.

Nei batteri, si tratta di un complesso multimerico. È importante formare complessi tra proteine strettamente associate dal punto di vista della funzione, poiché ciò permette una maggiore efficienza del processo: il prodotto della prima reazione non diffonde nell'ambiente circostante, ma può essere subito utilizzato nella seconda reazione e il prodotto della seconda, nella terza.

Processo

1. Il piruvato viene attaccato dalla piruvato deidrogenasi che grazie alla tiamina pirofosfato va a legare un gruppo aldeidico per formare idrossietil TPP, grazie all'enzima E1.
2. Interviene la lipoamide in forma ossidata. Il TPP passa il gruppo a due atomi di carbonio sotto forma di acetile alla lipoamide e si forma un legame tioestere (tra l’acetile e la lipoamide).
3. La diidrolipoil transacetilasi (E2) fa passare il gruppo acetato dall’acetil-lipoamide al coenzima A formando sempre un legame tioestere. In questo caso, il coenzima A è disponibile all’interno del mitocondrio (uno dei reagenti).
4. A questo punto abbiamo liberato la diidrolipoamide, ma non più in forma ossidata (che è quella funzionante) ma in forma ridotta. Quindi, il compito del terzo enzima (diidrolipoil deidrogenasi) è quello di riossidare la diidrolipoamide in modo che possa ricominciare un altro ciclo di trasferimento su un’altra molecola di piruvato.
5. Questo E3 funziona col suo FAD legato in modo fisso che forma FADH₂, ma questo non è un prodotto della reazione bensì uno stato intermedio. Il vero prodotto della reazione arriva dopo perché i due elettroni del FAD vengono passati al NAD⁺ libero che diventa NADH libero.

Prodotti

• CO₂
• Acetil-coenzima A
• NADH

Il glucosio parte con 6 carboni, entra nella glicolisi e esce sempre con 6 carboni ma sotto forma di piruvato. Nella decarbossilazione ossidativa con la piruvato deidrogenasi si ha una perdita totale di 2 atomi di carbonio sotto forma di CO₂. Rimangono per molecola ogni glucosio due acetil-CoA ognuno con 2 carboni. Nel ciclo di Krebs, gli acetil-CoA entrano uno per volta ed escono come 2 molecole di CO₂, in totale 4 molecole di CO₂. Nel Krebs, abbiamo completato l'ossidazione del glucosio.

Ciclo di Krebs

Nella matrice mitocondriale

Nei batteri avviene nel citosol nelle invaginazioni della membrana. È fondamentale perché:

• Con l’ossigeno, si ossidano completamente gli alimenti negli organismi aerobi.
• Produce il potere riducente che poi andrà a dare la maggior parte dell’ATP attraverso la fosforilazione ossidativa.
• Quasi tutti gli intermedi del ciclo di Krebs sono fondamentali anche per tante altre vie.

Sintasi e sintetasi

Sintasi costruiscono molecole senza utilizzo di ATP, mentre sintetasi utilizzano ATP e GTP.

Processo

Si può dividere a metà:

• Completa ossidazione del glucosio grazie a CO₂ (da cui estraiamo 4e-).
• Ricostruzione dell’ossalacetato per rientrare nel ciclo. Si continua a rilasciare energia grazie agli elettroni dell’acetato che, se ossidato, rilascia ancora elettroni.

1. L’acetato (dall'acetil coenzima A) va a unirsi a una molecola di ossalacetato (intermedio prodotto dalla carbossilasi) che ha due possibilità:
   • Tanto ATP: va a dare glucosio simile a quella dell’aldolasi (4^o step della glicolisi) perché la citrato sintasi (liasi) mette insieme due atomi di carbonio dell’acetato con l’ossalacetato per formare il primo acido tricarbossilico (contiene tre gruppi COO-).
   • Poco ATP: va nel ciclo di Krebs che, grazie all'estrazione degli elettroni dell'acetato, produce NADH e FADH₂ che serviranno a produrre ATP.
2. L’aconitasi (isomerasi) ha la funzione di spostare un gruppo OH da un carbonio all'altro. Una volta preparato l’isocitrato, comincia l'ossidazione. Toglie una molecola d'acqua, forma un doppio legame nel passaggio intermedio e poi raggiunge la molecola d'acqua, spostando così l’OH grazie all’aiuto del centro ferro zolfo (costituito da atomi di ferro che sono tenuti insieme all'interno del sito catalitico dell'enzima). Le funzioni principali di questi centri sono:
   • Legare molecole d'acqua.
   • Nei processi di ossidoriduzione, quindi spostamento di elettroni da un passaggio all'altro nella fosforilazione ossidativa.
   L’aconitasi ferro non emico (il ferro non è legato al gruppo eme).
3. Le due reazioni:
   • NAD⁺ → NADH + H⁺ + CO₂
   • NAD⁺ + CoA → NADH + H⁺ + CO₂
   sono molto simili a quella della piruvato deidrogenasi. Perché il meccanismo è lo stesso della decarbossilazione ossidativa con l’estrazione di due elettroni e la riduzione di un NAD⁺ a NADH e la completa ossidazione di un carbonio che si stacca come CO₂.
   • La prima reazione è una decarbossilazione ossidativa dell'isocitrato deidrogenasi che forma chetoglutarato (intermedio per il metabolismo degli amminoacidi).
   • La seconda reazione è una decarbossilazione ossidativa con un’altra deidrogenasi (l'alfachetoglutarato deidrogenasi) che porta alla perdita del secondo atomo di carbonio dell'acetato (sotto forma di CO₂).
   A questo punto tutti gli atomi di carbonio del glucosio sono ossidati perché abbiamo 2 CO₂ prodotti dalla decarbossilazione ossidativa dei piruvati e 4 CO₂ prodotti qui.
4. Rimane ancora la possibilità di estrarre energia. Si forma quindi la succinil coenzima A. Succinil coenzima A → succinato è l’unico passaggio in cui si forma energia in GTP.
5. A questo punto, arrivati al succinato, tutta la seconda fase la possiamo considerare la ricostituzione dell’ossalacetato. Alla fine, l’unico vero reagente consumato è l'acetato perché l’ossalacetato si riforma. Dalla formazione del succinil CoA in poi si implicano due reazioni di ossidazione (non più di decarbossilazione) perché l’ossalacetato è semplicemente una molecola più ossidata.
6. Tra le quattro reazioni di ossidoriduzione del ciclo, l’unica che utilizza il FAD è la reazione che dal succinato porta alla formazione di fumarato. Perché viene usato il FAD? Perché il FAD è implicato nei processi di ossidazione in cui si formano doppi legami mentre il NAD⁺ nei processi in cui viene ossidato un carbonio che abbia legato un ossigeno.

Produzione totale del ciclo

• Due molecole di CO₂ per ogni molecola di piruvato
• Completamente ossidato i due carboni dell’acetato
• 6 elettroni legati al NADH che andranno a dare 7,5 molecole di ATP nella fosforilazione ossidativa e 1 molecola di FADH₂ che andrà a dare 1,5 molecole di ATP nella fosforilazione ossidativa.

Fino a qui abbiamo 9 molecole di ATP. La decima molecola di ATP è data dal legame ad alta energia.

Stechiometria del ciclo di Krebs

• L’acetil coenzima A → 2 CO₂ + coenzima A libero
• I 3 NAD⁺ vengono ridotti a 3 NADH
• Il FAD viene ridotto a FADH₂
• Un GDP viene trasformato in GTP

Il ciclo di Krebs svolge una funzione anaplerotica perché mantiene livelli abbondanti di tutti gli intermedi. Quindi diversi enzimi del ciclo di Krebs svolgono una funzione anaplerotica, cioè di mantenimento dei livelli elevati degli intermedi metabolici.

Gli intermedi del ciclo di Krebs sono importanti anche per altri motivi:

• Il citrato è importante per diversi tipi di grassi
• Chetoglutarato è fondamentale nel metabolismo degli amminoacidi e per costruire gli anelli purinici
• Il succinil coenzima A è un precursore dell’eme ma anche della clorofilla nelle piante
• L’ossalacetato è un intermedio importante nel metabolismo degli amminoacidi perché da aspartato, importante anche per costruire le basi puriniche e pirimidiniche

La regolazione della piruvato deidrogenasi

La piruvato deidrogenasi (E1) è regolata:

• Dalla defosforilazione che attiva l’enzima
• Dalla fosforilazione che inattiva l’enzima e quindi tutto il complesso (perché inattivando il primo enzima si blocca tutta la catena di reazioni) tappa di comando

La regolazione del ciclo di Krebs

È una regolazione da carica energetica:

• L’ATP ha alta carica energetica e ha un effetto negativo, va ad inibire diversi enzimi
• Il NADH è indice di carica energetica elevata (vuol dire che la fosforilazione ossidativa non ce la fa a svuotare di elettroni tutto il NADH prodotto) effetto negativo
• Sull’enzima isocitrato deidrogenasi, l’ADP agisce da effettore allosterico positivo, effetto positivo / attivatore

Via del pentoso fosfato

O shunt dei pentosi, nel citosol, divisa in due parti:

1. Parte ossidativa: vie principali per la produzione di NADPH (trasportatore di elettroni attivati, necessario per le biosintesi riduttive e serve agli enzimi che lo riconosceranno grazie alla sua alta affinità)
2. Parte non ossidativa: serve per poter utilizzare questa via nelle diverse condizioni metaboliche in cui potrebbe trovarsi la cellula. In particolare consistono nell’interconversione di zuccheri che presentano da 3 a 7 atomi di carbonio (senza un processo di ossidoriduzione, caratteristico invece della prima parte).

NADH ossidato dalla catena respiratoria per dare ATP. NADH serve come donatore di elettroni nelle biosintesi riduttive.

Parte ossidativa

Trasformazione di una molecola di glucosio 6-fosfato in di ribosio 5-fosfato grazie ad una reazione di decarbossilazione ossidativa: sei atomi di carbonio a cinque atomi di carbonio e riduzione di due molecole di NADP⁺ a due molecole di NADPH. Avviene pertanto l’estrazione di quattro elettroni che vengono conservati nel NADPH (utilizzato nelle vie anaboliche e per il mantenimento dell’ambiente riducente nel citosol delle cellule). Il glucosio 6-fosfato anziché continuare la glicolisi può essere utilizzato per la parte ossidativa di questa via caratterizzata dall’azione di tre enzimi che agiscono in sequenza.

1. Il primo enzima utilizzato è la glucosio 6-fosfato deidrogenasi che catalizza la prima ossidazione con riduzione di un NADP⁺ per dare NADPH con estrazione di due elettroni. Il prodotto di questa reazione è il 6-fosfogluconolattone.
2. Il 6-fosfogluconolattone è una forma chiusa e per questo motivo agisce una lattonasi (un’idrolasi che permette l’apertura dell’anello) a dare 6-fosfogluconato. Quest’ultimo passaggio è preparatorio per la seconda reazione di ossidazione, che ancora una volta non è altro che una decarbossilazione ossidativa; quindi viene completamente ossidato un atomo di carbonio del glucosio 6-fosfato e vengono estratti contemporaneamente altri due elettroni a dare una seconda molecola di NADPH.
3. Si produce una molecola di ribulosio 5-fosfato (non ancora ribosio) e due molecole di NADPH. Il ribulosio 5-fosfato non è direttamente utilizzabile, ma può essere convertito in ribosio 5-fosfato da una isomerasi, la fosfopentosoisomerasi.

Parte non ossidativa

È caratterizzata da conversioni tra forme di zuccheri con diverso numero di atomi di carbonio. Ci sono due gli enzimi fondamentali che permettono queste conversioni:

• Transchetolasi: catalizza l’aggiunta o lo spostamento di gruppi a due atomi di carbonio (gruppi aldeidici) che vengono attivati da un derivato della vitamina B1, ovvero il tiamina pirofosfato (TPP). La reazione consiste nel trasferimento di un gruppo aldeidico attivato dal legame con la TPP (che fa parte dell’enzima transchetolasi), ad un altro zucchero per formare degli intermedi da 3 a 7 atomi di carbonio che possono servire a produrre alcuni intermedi della glicolisi. Catalizza anche una reazione reversibile tra due molecole a 5 atomi di carbonio e dare come prodotti una molecola a 3 atomi di carbonio (che potrebbe essere la gliceraldeide 3-fosfato) e una a 7 atomi di carbonio.
• Transaldolasi: catalizzano invece processi che permettono di spostare gruppi a tre atomi di carbonio di tipo di-idrossi-acetone da uno zucchero ad un altro con la produzione di intermedi usati per catalizzare la conversione del ribosio 5-fosfato a dare intermedi della glicolisi o della gluconeogenesi (quindi fruttosio 6-fosfato o gliceraldeide 3-fosfato) che possono poi andare ad alimentare una delle due vie. Trasformare gli intermedi in ribosio 5-fosfato, percorrendo la reazione inversa.

Il destino del glucosio 6-fosfato dipenderà dalle necessità cellulari perché può essere usato nella glicolisi per formare piruvato ed estrarre energia sotto forma di ATP e di NADH, oppure entrare nella via del pentoso fosfato per formare zuccheri a 5 atomi di carbonio (precursori di vari tipi di basi nucleotidiche) e anche potere riducente per biosintesi riduttive.

Quattro possibili scenari

1. È necessario molto più ribosio 5-fosfato rispetto a NADPH (divisione cellulare). Se una cellula deve dividersi, essa deve essere ricca di energia. Il DNA da duplicare è costituito da miliardi di basi azotate sintetizzate a partire da ribosio 5-fosfato che deve essere altrettanto presente. Siccome la cellula necessita più ribosio 5-fosfato che NADPH, è possibile (tramite transchetolasi e transaldolasi) sfruttare la parte non ossidativa della via del pentoso fosfato per costruire ribosio 5-fosfato a partire dagli intermedi della glicolisi, ovvero fruttosio 6-fosfato e gliceraldeide 3-fosfato. La reazione è spinta verso la produzione di ribosio 5-fosfato in quanto quest’ultimo verrà man mano eliminato dall’equilibrio perché utilizzato per la produzione di basi azotate.
2. C’è uguale necessità di ribosio 5-fosfato e NADPH. In questo caso è sufficiente sfruttare la parte ossidativa della via del pentoso fosfato perché per una certa quantità di glucosio 6-fosfato ossidato otteniamo una corrispondente quantità di NADPH e ribosio 5-fosfato prodotto.
3. Caso in cui è necessario ottenere maggiore NADPH rispetto a ribosio 5-fosfato. Si sfrutta al massimo la via ossidativa e al contempo si limita la produzione di ribosio 5-fosfato.
   • Nel fegato, dove in caso di abbondanza di energia, vengono prodotte sostanze di riserva come i trigliceridi. I trigliceridi sono composti da acidi grassi e glicerolo, e proprio nella sintesi di acidi grassi si parte da una molecola parzialmente ossidata come l’acetil CoA e si arriva a una catena del tutto satura di atomi di carbonio (acido grasso), e per questo passaggio si utilizzano molti elettroni per mezzo di NADPH. Quindi il fegato e tessuto adiposo hanno bisogno di utilizzare in quelle fasi molto NADPH mentre non hanno necessità di ribosio 5-fosfato.
   • Nella ghiandola mammaria, durante la lattazione, le cellule devono produrre anche abbondanti acidi grassi, quindi anche qui la via del pentoso fosfato (la parte ossidativa) deve procedere velocemente per produrre grosse quantità di NADPH.