Appunti prima parte della lezione di Citologia e istologia: laboratorio

COLTURE BATTERICHE

Le cellule procarioti che sono importanti in quanto contengono i plasmidi - sfruttati

per inserire e trasferire materiale genetico [anche i lieviti nonostante siano

eucarioti posseggono i plasmidi]

Possiamo avere due tipi di coltura cellulare

Quelle di microorganismi, come escherichia coli o lievito (cerevisae)

Quelle di eucarioti superiori

Importante in tutte le colture lavorate in sterilità x evitare contaminazioni esterne

Metodi di sterilizzazione

al calore, permette di uccidere tutti i microorganismi in pochi secondi

Calore rosso, su fiamma Bunsen per sterilizzare attrezzi di metallo o di

vetro con alcool

Calore secco, in cui si utilizza una stufa a 160C per almeno due ore - per la

vetreria

LABORATORIO VENTURIN 1

Calore umido, in cui si utilizza lʼautoclave a 121C per almeno 15min ad alta

pressione - si utilizza il vare acqueo per uccidere microorganismi in

soluzioni o mezzi di coltura (non devono essere pero sensibili al calore)

radiazioni, i raggi UV causano la formazioni di dimeri di timina negli organismi

con quindi errori di replicazione che portano al blocco del ciclo cellulare - si

usano per sterilizzare articoli monouso in plastica che con il calore si

scioglierebbero - se pero voglio avere un effetto più drastico ad esempio di

vetro e carta uso quelle ionizzanti

Filtrazione, con pori di dimensioni variabili di nitro cellulosa - questo filtro non

fa passare la maggior parte dei microorganismi ma solo i liquidi.

Agenti chimici, come disinfettantiIn generale per mantenere il luogo di lavoro

pulito si possono applicare metodi diversi

disinfestazione del luogo di lavoro (a differenza della sterilizzazione non

abbiamo lʼeliminazione delle spore, ma solo una diminuzione drastica dei

batteri)

Sterilizzazione su fiamma bunsen + flambatura dei contenitori su questa

fiamma

Cappa a flusso laminare

COLTURE BATTERICHE

Requisiti del terreno di coltura:

Devono riprodurre le condizioni di crescita normali di questi batteri

acqua

Macronutrienti: elementi necessari a tutti i microorganismi - servono per la

biosintesi ma anche perche entrano a far parte delle componenti principali

della cellula

Carbonio, idrogeno, ossigeno, zolfo e fosforo - sono usati in quantità

piu elevate rispetto agli altri sali

Potassio, magensio, ferro sono necessari sempre

Sodio e calcio, necessari solo in alcuni gruppi e solo in determinati

momenti

LABORATORIO VENTURIN 2

micronutrienti: elementi necessari alla cellula, ma in quantità piu esigue - di

solito bastano le tracce che si trovano in sali o acqua.

Cobalto, zinco, molibdeno, rame, manganese e nickel

Terreno

Terreni sintetici o definiti: terreni di cui si conosce lʼesatta

composizione e sono preparati ad hoc a seconda delle esigenze

nutrizionali.

Terreni complessi: non si conosce ogni sostanza presente ma va a

soddisfare le esigenze nutrizionali di molti organismi - non si conosce

la composizione chimica ma permette di far crescere piu colonie

differenti allo stesso momento.

Possono contenere: estratti di carne magra, estratti di lieviti,

peptoni/triptoni (derivano da una parziale digestione proteolitica

degli enzimi digestivi)

Classificazione qualitativa dei terreni:

terreni elettivi, ricchi di nutrienti, spesso hanno sangue di pecora o di

cavallo - consentono la crescita di quasi tt le specie

Terreni selettivi, solo particolari specie batteriche perchè hanno fattori che

inibiscono lo sviluppo di altre specie

Terreni differenziali, permettono di distinguere tra diversi gruppi batterici

grazie alle loro componenti

Terreni di arricchimento, sono simili al selettivo ma con un comportamento

opposto - do vantaggio di crescita alla specie che voglio io, do dei fattori di

crescita specifici.

I terreni di coltura possono essere solidi (piastre petri, becco a clarino) o liquidi

(beute, provette)

Lʼagar- inizialmente Koch pensò di utilizzare una fettina di patata per far crescere

ed isolare gli organismi, ma non tutti crescevano, allora provo con la gelatina per

alimenti ma a 37 gradi si scioglieva e moti batteri avevano enzimi che la

degradavano; infine grazie a Fenny e Walter Hesse trovarono una sostanza

estratta dalle alghe rosse che era lʼagar.

LABORATORIO VENTURIN 3

Agar: polisaccaride estratto dalle alghe rosse con la concentrazione dellʼ1/2% 

produce un gel rigido che si scioglie a 98C e rimane liquidò fino ai 4445C 

utile perche si possono aggiungere anche componenti labili al calore.

Fattori che influenzano la crescita batterica

temperatura

Ossigeno - è importante sapere se un organismo è aerobio o no (ci possono

essere aerobi obbligati o facoltativi, che vivono anche in assenza di ossigeno

ma hanno una crescita piu faticosa)

aerobi obbligati, utilizzano la fosforilazione ossidativa

Anaerobi obbligati, utilizzano il metabolismo fermentativo

Microaerofili, possono crescere in presenza di aria ma vivono meglio in

concentrazioni minori

Come si capisce a primo impatto se una coltura è anaerobia o aerobia? Dipende

da dove va a disporsi quando la piastriamo - se stanno verso lʼalto saranno aerobi

obbligati, verso il basso anaerobi obbligati, nel messo saranno microaerofili e in

tutto il resto anaerobi facoltativi.

Cʼè anche unʼaltra classe che sono i aereotolleranti che sono quelli che presentano

la perossidasi (se ce lʼhanno tollerano lʼo2 se no non riescono ad eliminare i

radicali liberi e non lo tollerano)

il pH, importante distinguere tra neutrofili o basofili

La crescita batterica

È una crescita esponenziale — pero è importante sapere che la crescita batterica

è composta da varie fasi:

fase lag: serve ai batteri per ambientarsi al nuovo terreno - non abbiano

crescita

Fase esponenziale

Fase stazionaria: fase di plateau perché il terreno si consuma

Morte o decrescita logaritmica: se non si cambia terreno

LABORATORIO VENTURIN 4

Cosʼè esattamente una colonia batterica: popolazione di cellule batteriche che

derivano da una singola cellula vitale che cresce in un punto specifico del terreno

solidificato - le prime cellule a formare la colonia sono dette colony-forming unit

CFU

Metodo di piastratura

piastre di diluizione strisciata: con una pipetta su mette un poʼ di coltura

cellulare su una petri, poi si prende unʼasta metallica sterilizzata e la facciamo

strisciare sul terreno.

Piastra a versamento: si prende una coltura e si versa in una petri e dopo si

aggiunge terreno con agar liquido - le cellule cresceranno in superficie e

anche nel mezzo

A spargimento: prendiamo della coltura liquida e la poniamo nel centro della

piastra dove abbiamo il terreno solidificato e poi la spargiamo con unʼasta di

vetro mentre giriamo la petri.

Misurazione della crescita batterica

Metodi diretti ed indiretti

diretto:

conta su piastra

Viene effettuata dopo una diluizione in serie(110100

Poi si prende e si mette su piastre diverse in base alle diluizioni

Si lasciano incubare, poi dopo che le varie colonie sono cresciute si

osservano

Si conta il numero di colonie relativo (generalmente si conta dalla

piastra 110.000 e si fa la conta per ml;

Poi per capire la la concentrazione del terreno iniziale si fa un calcolo:

conta per ml = C/V x M, i cui C è la conta media per piastra, V è il

volume di voltura piastrato e M è il reciproco della diluizione.

Filtrazione

Conta di provette multiple o numero più probabile

LABORATORIO VENTURIN 5

Conta diretta al microscopio; si utilizza la camera di conta (emocitometro)

Indiretto:

Assorbanza allo spettrofotometro, sfrutta la legge di lambert beer perché

tramite lʼassorbanza ricaveremo la concentrazione.

Saggi di attività metabolica

COLTURE DI CELLULE ANIMALI E VEGETALI

Diversi tipi di studi:

In vitro, massimo controllo sullʼassetto sperimentale e massima riproducibilità

ma avremo una differenza grande tra il modello in vitro e quello reale

In vivo, vantaggio di comprendere tutti gli apparati e quindi abbiamo il modello

completo, ma ce il controllo minimo sullʼassetto sperimentale

Colture cellulare, si mantiene una parte della complessità biologia allʼinterno

dellʼorganismo perche le cellule interagiscono tra di loro come nei tessuti -

controllo maggiore dellʼassetto sperimentale. Importante perche si riesce a

sostituire il modello animale.

Ci sono vantaggi e svantaggi per le colture cellulari

vantaggi:

riproducibilità degli esperimenti e rapidità di risposta

Controllo delle variabili ambientali

Analisi di meccanismi cellulari e molecolari

Riduzione del numero di animali

Disponibilità commerciale di terreni e fattori di crescita

Svantaggi:

sistema semplificato rispetto ad un organismo integrato

Condizione di esposizione alle sostanze diverse da quello

dellʼorganismo in toto - la risposta ai farmaci o ad altre sostanze sarà

differente da quella ottenuta dallʼorganismo in toto

Rischio di interazione delle sostanze con il terreno di coltura

LABORATORIO VENTURIN 6

Instabilità genica durante i passaggi di coltura - possibilità di mutazioni

cromosomiche

Le possibili applicazioni

Tipi di colture di cellule animali

colture primarie - una coltura nasce sempre come coltura primaria; le cellule

vengono prelevate dal terreno di origine e mantengono le loro proprietà che

avevano in vivo - alcuni tipi cellulari sono in grado di espandersi piu di altri - la

vita delle cellule comunque prima o poi finisce percio non si può mantenere

una coltura primaria per troppo tempo perché poi le risorse finiscono - ad un

centro punto si stoppa la duplicazione.

Colture secondarie - quando una cultura primaria ha esaurito le sue risorse

bisogna fare delle sub culture che hanno caratteristiche più omogenee delle

primarie, quindi prendiamo una parte cellulare e la trasportiamo in un terreno

nuovo e poi via via che si trapiantano in altri terreni si crea una linea cellulare

perché ad un certo punto questi terreni possono arrivare a contenere un solo

tipo cellulare o addirittura una sola cellula che poi verra clonata cosi da avere

una coltura totalmente omogenea.

Sostanzialmente le colture secondarie derivano dalle colture primarie per sub

cultura e consentono la selezione di determinati tipi cellulari.

Colture clonali - colture derivanti da unʼunica cellula che presentano

popolazione omogenea.

Colture continue - derivano da primarie o secondarie e sono linee cellulari

immortalizzate grazie ad una mutazione che puo essere:

LABORATORIO VENTURIN 7

Trasformazione spontanea (viene mandato fuori controllo il ciclo cellulare

e si permette una duplicazione senza inibizione da contatto etc)

Trasformazione indotta, mediante trasduzione di un virus che va a inibire i

geni oncorepressori

Espianto di tumori,