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2. CELLULE E TESSUTI DEL S. I.

Linfociti

Originano da cellule staminali del midollo osseo; sono le uniche cellule dell’organismo in

grado di riconoscere e distinguere i diversi antigeni e sono responsabili della

specificità e della memoria.

Le proteine presenti sulla membrana cellulare sono usate come marcatori fenotipici: i

linfociti T helper esprimono CD4, i CTL esprimono CD8. CD sta per cluster

differentation, quindi una molecola riconosciuta da un cluster (gruppo) di anticorpi

monoclonali, che possono essere usati per identificare lo stadio di differenziazione

dei linfociti.

LINFOCITI T VERGINI : non hanno mai incontrato l’antigene, sono anche conosciuti

come piccoli linfociti (diametro di 8-10 e si trovano in uno stato di quiescenza.

µm)

All’interno del linfonodo si trovano particolari venule post capillari ad alto endotelio, le

HEV, che presentano un elevato grado di adesività da parte dei linfociti T vergini, che

quando urtano l’endotelio vi rimangono adesi per molti secondi e una parte di essi

aumenta l’adesività e si fa larga fra le cellule endoteliali fino al linfonodo; nel

linfonodo i linfociti T vergini possono essere attivati dall’antigene accumulato, ma se

ciò non avviene lasciano il linfonodo e vanno a localizzarsi in un altro e così via.

LINFOCITI T EFFETTORI : escono dai linfonodi e si localizzano nei focolai

infiammatori, perché le citochine potenziano l’espressione sulle cellule endoteliali di

ligandi per le integrine E- e P-selectina, la cui espressione è notevolmente aumentata

sui linfociti T attivati.

LINFOCITI B : risiedono in tessuti linfoidi periferici, dato che secernendo anticorpi

non hanno bisogno di migrare. I linfociti B vergini migrano dal sangue ai follicoli

linfatici in risposta a chemochine prodotte nei follicoli, le BLC; quando la cellula è

stata attivata l’espressione dei recettori per BLC diminuisce e il linfocita B maturo

può lasciare il follicolo.

Cellule accessorie

FAGOCITI MONONUCLEATI : originano nel midollo osseo e maturano e si attivano

nei diversi tessuti. Quando lasciano il midollo osseo prendono il nome di MONOCITI e

nei tessuti maturano diventando MACROFAGI. Presentano l’antigene ai linfociti T e

producono proteine di membrana che fanno da segnale per l’attivazione di linfociti T.

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CELLULE DENDRITICHE : presentano numerosi prolungamenti citoplasmatici

ramificati. Captano e trasportano gli antigeni proteici ai linfonodi, si localizzano nelle

aree linfonodali contenenti linfociti T e presentano l’antigene.

CELLULE FOLLICOLARI DENDRITICHE : presentano prolungamenti citoplasmatici e

sono presenti solo nel centro germinativo di linfonodi, milza e tessuto linfoidi. Captano

antigeni combinati ad anticorpi o a prodotti del complemento e li presentano ai

linfociti B.

Tessuti linfoidi

MIDOLLO OSSEO : è la sede dell’emopoiesi. La proliferazione e la maturazione delle

cellule del S.I. sono stimolate dalle citochine, prodotte da cellule stromali, da

macrofagi midollari, da linfociti T stimolati dall’antigene e da macrofagi attivati da

citochine o microbi.

TIMO : la corticale è ricca in linfociti T, la midollare presenta i corpuscoli di Hassal,

strati concentrici di cellule epiteliali. La maturazione dei linfociti T inizia nella

corticale e via via che maturano i timociti migrano verso la midollare e una volta

maturi entrano in circolo.

MILZA : è un filtro per il sangue e il sito principale della fagocitosi di microbi

opsonizzati (rivestiti da anticorpi). I macrofagi della polpa rossa eliminano dal circolo

microbi e materiale particolato.

LINFONODI : sono piccoli aggregati cellulari di tessuto linfoide. Nella corticale le

cellule formano i FOLLICOLI, che si dicono primari se non presentano un centro

germinativo e secondari se lo presentano. I follicoli primari sono popolati

principalmente da linfociti B maturi vergini. I centri germinativi si sviluppano in

risposta alla stimolazione antigenica: in essi i linfociti B proliferano, vengono

selezionati quelli che producono anticorpi ad elevata affinità e si generano cellule

della memoria. La paracorticale è ricca in linfociti T.

SISTEMA LINFATICO : raccoglie l’antigene e lo convoglia verso i linfonodi, disposti

regolarmente lungo il decorso dei vasi linfatici, che si comportano come filtri nei

confronti della linfa. Gli antigeni entrati in circolo possono essere captati da

macrofagi, cellule dendritiche del linfonodo e dai linfociti B (che a livello linfonodale

riconoscono anche antigeni solubili) che lo processano e lo presentano ai linfociti T.

CUTE : le cellule di Langerhans formano un reticolo sottocutaneo che capta gli

antigeni che penetrano attraverso la cute e, dopo la stimolazione di chemochine,

migrano nel derma e raggiungono i linfonodi per via linfatica. Pagina 5 di 61

SEZIONE II

3. ANTICORPI E ANTIGENI

Anticorpi

Sono presenti nel plasma, nelle secrezioni mucose e nel fluido interstiziale e il loro

studio è definito SIEROLOGIA. In circolo hanno un’emivita di circa 3 settimane e la

concentrazione anticorpale per un dato antigene viene stabilita per titolazione (per

diluizioni sempre maggiori del siero). Dato che nell’elettroforesi la maggior parte degli

anticorpi forma il terzo picco di migrazione questi sono anche definiti γ-globuline.

Sono prodotti dai linfociti B sotto forma di molecole di membrana che servono da

recettore per l’antigene; quando il linfocita B viene stimolato parte la produzione di

anticorpi anche in forma secreta; sono sintetizzati sui ribosomi del RER e associate

con ponti disolfuro nel RE; dopo l’assemblaggio le Ig sono convogliate alle cisterne

dell’apparato del Golgi e trasportate verso la membrana. I linfociti B che producono

anticorpi ad affinità più elevata sono stimolate dall’antigene in maniera preferenziale

e diventano al popolazione dominante ad una successiva riesposizione secondo un

processo detto MATURAZIONE DELL’AFFINITA’.

La loro struttura è stata definita grazie alla tecnica dell’ “ibridoma”, che prevede la

fusione di un linfocita B normale e di uno di mieloma. Tutti gli anticorpi hanno

identiche caratteristiche strutturali, ma una notevolissima variabilità nelle regioni che

legano l’antigene: ogni anticorpo è formato da una struttura simmetrica di 2 catene

leggere identiche (24 KD) e di 2 catene pesanti anch’esse identiche (55-70 KD).

Ognuna delle catene leggere è legata ad una catena pesante da ponti disolfuro, cosi

come le 2 catena pesanti tra loro.

Tutte le catene contengono una serie di unità omologhe di 110 a.a. che si ripiegano a

formare un motivo globulare, il dominio Ig, che contiene 2 strati di foglietto formati

β

da 4-5 nastri antiparalleli (SUPERFAMIGLIA DELLE IG).

Le catene, pesanti e leggere, presentano una regione variabile (V) N-terminale e una

regione costante (C) C-terminale. Nelle catene pesanti la regione V contiene un solo

dominio Ig,mentre la regione C ne contiene 3-4; nelle catene leggere sia la regione V

) è

che la regione C contiene un solo dominio Ig. La regione V di una catena pesante (V

H

giustapposta alla regione V di una catena leggera (V ) a formare il sito di legame per

L

l’antigene; quindi ogni molecola Ig ha 2 siti di legame per l’antigene. La regione V

possiede 3 segmenti ipervariabili, tenuti assieme da cornici più conservative, e sono

indicati con le sigle CDR1, CDR2 e CDR3.

Gli anticorpi sono distinti in classi, o ISOTIPI (IgA,IgD,IgE,IgG e IgM), e sottoclassi

in base alla struttura delle regioni C delle catene pesanti; la maggior parte delle

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funzioni effettrici è proprio data dal legame delle regioni C delle catene pesanti su

recettori cellulari o proteine del complemento. Quindi la regione V è responsabile del

riconoscimento dell’antigene grazie alle sequenze amminoacidiche specifiche in essa

contenute. La regione C è responsabile delle funzioni effettrici,principalmente le

regioni C delle catene pesanti,perché queste legano l’anticorpo sulla superficie dei

linfociti B.

Le molecole anticorpali sono flessibili grazie ad una regione cerniera sita in certi

1 e C 2 (10-60 a.a.). Esistono 2 isotipi di catena leggera che si

isotipi tra i domini C

H H

differenziano per le regioni C-terminali e denominate κ e λ. Ogni Ig possiede o due

catene κ o due catene λ.

Gli anticorpi possono essere espressi in 2 forme: nella forma secreta la sequenza C-

terminale è costituita da residui carichi ed idrofili, nella forma di membrana la

sequenza C-terminale presenta 26 a.a. con catene laterali idrofobiche seguiti da

residui basici.

Con il clivaggio proteolitico delle IgG si ottengono frammenti con caratteristiche

strutturali e funzionali differenti: le IgG di coniglio trattate con papaina si separano

in 3 frammenti, 2 che conservano la capacità di legare l’antigene detti Fab (fragment

antigen binding) e un terzo, detto Fc, che conserva la capacità di attivare il

complemento. Se invece le IgG di coniglio sono trattate con pepsina,il clivaggio

interessa la regione C-terminale e si formano due frammenti: un frammento

contenente i due domini Fab in grado di legare l’antigene e la regione cerniera con i

due ponti disolfuro , il secondo frammento invece non sarà in grado di legarsi allo

specifico recettore presente sulla superficie delle cellule effettrici.

La presenza di anticorpi specifici prende il nome di DIVERSIFICAZIONE e l’insieme

degli anticorpi dotati delle diverse specificità è detto REPERTORIO ANTICORPALE.

Antigene

È ogni sostanza in gradi di legarsi specificamente ad una molecola anticorpale o ad un

recettore antigenico sui linfociti T: gli anticorpi possono riconoscere come antigene

quasi ogni tipo di molecola biologica (intermedi metabolici, zuccheri, lipidi , ormoni,

carboidrati complessi, acidi nucleici e proteine), i linfociti T riconoscono solo peptici.

Tutte le molecole che sono in grado di innescare una risposta immunitaria sono

definite IMMUNOGENI. Solo le macromolecole possono stimolare i linfociti B, quindi

una piccola molecola, APTENE, è coniugata ad una macromolecola, CARRIER, affinché

il complesso aptene-carrier possa comportarsi da immunogeno. L’anticorpo si lega ad

una sola porzione della macromolecola, l’EPITOPO, e una macromolecola che possiede

determinanti multipli in uno stesso antigene è detta multivalente. L’organizzazione

spaziale può influire sul legame con gli anticorpi (effetto allosterico). Pagina 7 di 61

Gli epitopi formati da una sequenza lineare di a.a. sono detti DETERMINANTI

LINEARI (6 a.a.) e sono accessibili agli anticorpi se esposti sulla superficie esterna

dell’antigene. I DETERMINANTI CONFORMAZIONALI sono formati da a.a. non in

sequenza e si creano per la giustapposizione spaziale. Le proteine possono andare

incontro a modifiche e quindi generare nuovi epitopi detti DETERMINANTI NEO-

ANTIGENICI.

Il riconoscimento dell’antigene da parte dell’anticorpo presuppone un legame non

covalente e reversibile, e la forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un

epitopo antigenico viene chiamata AFFINITA’ dell’anticorpo, espressa come costante

di dissociazione (Kd) che definisce la concentrazione di antigene necessaria per

occupare i siti combinatori di metà delle molecole di Ig presenti in una data soluzione

di anticorpo.

L’AVIDITA’ è la forza complessiva fra il legame degli anticorpi a tutti gli epitopi

antigenici. Solo l’interazione completa fra antigene polivalente e anticorpi permette di

innescare in maniera ottimale molte delle funzioni effettrici svolte dagli anticorpi

stessi. Le diverse funzioni effettrici degli anticorpi sono innescate dal legame

specifico degli antigeni e dal coinvolgimento di altre molecole o cellule effettrici;

l’elevato grado di specificità è necessario ad evitare che gli anticorpi reagiscano con

strutture autologhe correlate a strutture estranee.

Quando stimolato dall’antigene un clone di linfociti B può produrre anticorpi di isotipo

diverso (regione C diversa) ma con gli stessi domini V (SCAMBIO ISOTIPICO).

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4. COMPLESSO MAGGIORE ISTOCOMPATIBILITA

Gli antigeni microbici sono presentati ai linfociti T da una particolare classe di

proteine codificate da geni che mappano nel locus denominato COMPLESSO

MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA’ – MHC.

Le molecole MHC sono parte integrante dei ligandi riconosciuti dai linfociti T e si

distinguono in molecole MHC di classe I e di classe II, e quelle umane sono chiamate

antigeni leucocitari umani HLA.

I 2 tipi di geni MHC, che sono polimorfi (esistono forme alternative presenti in una

percentuale variabile degli individui di una data popolazione), codificano 2 gruppi di

proteine omologhe ma strutturalmente distinte. Sono geni espressi in maniera

codominante, cioè ogni individuo esprime gli alleli MHC presenti su entrambi i

cromosomi, permettendo di sfruttare al massimo il numero di molecole MHC disponibili

a legare peptici antigenici. Il set di alleli presenti su ciascun cromosoma è definito

APLOTIPO MHC.

Ogni molecola MHC contiene una tasca di legame per il peptide, seguita da una coppia

di domini a tipo Ig, ed è ancorata alla cellula da un dominio transmembrana e da un

dominio intracitoplasmatico. I residui aminoacidici polimorfi sono situati all’interno e

nelle vicinanze della tasca di legame per il peptide, che è formata dal ripiegamento

dell’estremità N-terminale delle catene: è composta da una coppia di che

α-eliche

formano le pareti che sono montate su un pavimento di 8 foglietti I domini Ig non

β.

polimorfi contengono siti di legame per i recettori CD4 (helper) e CD8 (CTL) dei

linfociti T. Cd4 si lega alle molecole MHC di classe II,mentre CD8 si lega alle molecole

MHC di classe I.

Molecole MHC di classe I

Sono formate da 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente:

catena 44-47 KD, che è codificata nell’MHC;

α:

catena -microglobulina: che non è codificata nell’MHC.

β 2

La catena è disposta per i ¾ della sua lunghezza all’esterno della cellula; un breve

α

segmento idrofobico attraversa la membrana; i residui C-terminale sono situati nel

citoplasma.

Nella catena all’estremità N-terminale, troviamo 2 domini, e ciascuno di circa

α, α1 α2,

90 a.a. che formano il pavimento degli 8 nastri antiparalleli di foglietto che

β

sostengono 2 pareti di (le estremità della tasca sono chiuse). La tasca può

α-elica

accogliere peptidi di 8-11 a.a., quindi le proteine globulari devono essere processate

per generare frammenti più piccoli. Pagina 9 di 61

I domini e sono polimorfi e sono responsabili del legame del peptide e del

α1 α2

riconoscimento da parte di cloni di linfociti T differenti. Ogni individuo eterozigote

esprime su ogni cellula nucleata 6 diverse molecole di classe I, codificate dai 2 alleli

dei geni HLA-A, HLA-B e HLA-C. Il dominio presenta una sequenza che è

α3 +

conservata in tutte le molecole di classe I e serve come sito di legame per CD8 .

-microglobulina, che non è codificata da un gene dell’MHC, interagisce in maniera

La β 2

non covalente con possiede la struttura di un dominio Ig e non varia fra l e varie

α3,

molecole di classe I.

Una molecola di classe I completamente assemblata è un eterotrimero di catena -

α, β 2

microglobulina e peptide antigenico legato. La loro espressione stabile sulla membrana

richiede la presenza di tutti e tre i componenti.

Molecole MHC di classe II

Sono formate da 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente, codificate da

geni MHC polimorfi:

catena 32-34 KD;

α:

catena 29-32 KD.

β:

La tasca di legame per il peptide è data dall’interazione dei segmenti N-terminali e

α1

quindi 4 nastri di foglietto sono dati da e 4 da Anche in questo caso i

β1, β α1 β1.

residui polimorfi sono localizzati all’interno e all’estremità della tasca, le quali però

sono aperte in modo da poter accogliere peptidi anche maggiori di 30 a.a.

I segmenti e formano domini Ig e non sono polimorfi, ma il dominio possiede

α2 β2 β2

la regione di legame per CD4. il numero totale di molecole di classe II espresse da un

individuo eterozigote è di circa 10-20. Le estremità C-terminali si continuano con un

elemento di connessione seguito da 25 a.a. idrofobici transmembrana e una breve coda

citoplasmatica.

Alle molecole MHc di classe II neosintetizzate sono associati peptici non polimorfi

chiamati catene invarianti. Queste condizionano il legame dell’antigene nella tasca

della molecola stessa.

Una molecola di classe II completamente assemblata è un eterotrimero composto da

una catena da una catena e dal peptide antigenico legato.

α, β Pagina 10 di 61

Interazione peptide-MHC

Ogni peptide verso il quale si possa generare una risposta immunitaria deve possedere

residui per il riconoscimento delle sequenze polimorfe delle molecole MHC e residui

che vengono riconosciuti dai linfociti T(epitopi).

Ogni molecola MHC possiede una sola tasca di legame per il peptide e in momenti

diversi può ospitare peptidi differenti. I residui del peptide che si legano all’MHC

sono differenti da quelli che si legano ai linfociti T. Le molecole MHC non distinguono

fra peptidi estranei e autologhi e quindi esprimono sia peptidi self che estranei.

Quindi i linfociti T controllano i peptidi complessati con le molecole MHC in modo tale

da individuare solo i peptidi estranei verso i quali è diretta la risposta immunitaria.

L’interazione è a bassa affinità, con un tasso di associazione basso e un tasso di

dissociazione ancora inferiore che permette ai complessi MHC-peptide di rimanere

sulla superficie delle cellule che presentano l’antigene abbastanza a lungo da

permettere l’interazione con i linfociti T.

Il legame dei peptidi alle molecole MHC è un’interazione non covalente fra i residui del

peptide e della tasca dell’MHC. I residui che si legano alla tasca nelle nicchie dei

foglietti sono detti RESIDUI ANCORA, e si trovano nel mezzo o nella fine del

β

peptide e ognuno ne contiene 1 o 2 (non tutti i peptidi li posseggono). Le α-eliche

intervengono sul peptide con ponti idrogeno o con ponti ionici.

Per il riconoscimento antigenico i residui peptidici sono responsabili della specificità, i

residui dell’MHC influiscono sulla risposta immunitaria. Quindi la specificità del

riconoscimento antigenico è dovuto alla selettività del recettore per l’antigene dei

linfociti T.

Organizzazione MHC

Nell’uomo il complesso MHC mappa sul braccio corto del cromosoma 6, mentre la -

β 2

microglobulina sul cromosoma 15. l’MHC umano occupa un segmento di DNA di 35000

Kb e codifica per molte molecole coinvolte nella processazione dell’antigene e nella

presentazione di questi ai linfociti T:

TAP: proteina eterodimerica che trasporta peptidi dal citosol al RE, dove si

• associano a molecole MHC di classe I neosintetizzate;

PROTEASOMA: genera i peptidi dalle proteine citosoliche;

• HLA-DM: proteina coinvolta nel legame dei peptidi alle molecole di classe II.

Tra i geni di classe I e classe II alcuni geni codificano componenti del sistema del

complemento, 3 citochine (TNF,linfotossina e linfotossina β)e alcune proteine da

stress; questi geni nell’insieme sono definiti MHC di classe III. Pagina 11 di 61

Le molecole di classe I sono espresse costitutivamente su tutte le cellule nucleate: i

linfociti T CD8, ristretti per la classe I, uccidono le cellule infettate da microbi

intracellulari, come i virus, e dato che questi possono infettare tutte le cellule

nucleate i ligandi riconosciuti da CD8 devono essere espressi da tutte le cellule

nucleate.

Le molecole di classe II sono espresse su cellule dendritiche, linfociti B, macrofagi e

pochi altri tipi cellulari: i linfociti T CD4, ristretti per la classe II, eliminano i microbi

extracellulari ed attivano i macrofagi ed i linfociti B, quindi devono interagire con n

numero ristretto di tipi cellulari.

L’espressione delle molecole MHC è potenziata dalle citochine, prodotte sia nel corso

delle risposte immunitarie innate che delle specifiche: IFN-α, IFN-β e IFN-γ

aumentano l’espressione dei geni di classe I, IFN-γ aumenta l’espressione dei geni di

classe II (può essere prodotto dalle cellule NK nella risposta immunitaria innata).

Le citochine potenziano l’espressione dell’MHC stimolando il tasso di trascrizione dei

geni di classe I e II mediante il legame a fattori trascrizionali nei promotori dei geni

MHC. Molti fattori di trascrizione possono essere assemblati e legarsi ad una proteina

detta “attivatore della trascrizione della classe II” (CIITA): il complesso si lega al

promotore e favorisce la trascrizione. Anche il CIITA viene sintetizzato in risposta a

IFN-γ. Pagina 12 di 61

5. PROCESSAZIONE E PRESENTAZIONE

DELL’ANTIGENE AI LINFOCITI T

Le cellule che espongono peptidi associati alle molecole MHC ai linfociti T sono dette

APC, cellule presentanti l’antigene. I linfociti T sono specifici per la sequenza

aminoacidica del peptide e li discriminano anche per un solo a.a., mentre i linfociti B

possono riconoscere determinanti presenti anche in proteine globulari.

La trasformazione da parte delle APC delle proteine native in frammenti peptidici che

si legano alle molecole MHC prende il nome di PROCESSAZIONE DELL’ANTIGENE,

inoltre le APC forniscono segnali ulteriori rispetto alla sola interazione con il

complesso MHC-peptide, e sono detti SEGNALI COSTIMOLATORI.

Gli epitopi antigenici più capaci di evocare una risposta T sono spesso quei peptidi che

si legano con maggiore avidità ai complessi MHC, e per questo sono detti EPITOPI

IMMUNODOMINANTI.

N.B. I linfociti T riconoscono solo peptidi; possono discriminare tra i diversi peptidi in

quanto possiedono una elevata specificità per la sequenza amminoacidica dell’epitopo.

Inoltre rispondono agli antigeni estranei soltanto quando i peptidi da essi derivati

sono presentati sulla superficie delle APC. I linfociti B invece sono in grado di

riconoscere proteine,peptidi, acidi nucleici,polisaccaridi,lipidi e composti chimici di

piccole dimensioni che attivano la risposta umorale. A differenza dei linfociti T,i

linfociti B e gli anticorpi da essi secreti legano sia gli antigeni solubili presenti nei

fluidi corporei,sia gli antigeni espressi sulla superficie cellulare. Questo dipende dal

fatto che i linfociti T durante la maturazione vanno incontro ad un processo di

restrizione per l’MHC self,così che maturano solo i linfociti T che sono in grado di

riconoscere i peptidi legati alle molecole MHC.

I linfociti T CD4 riconoscono gli antigeni legati alle molecole MHC di classe II. Questi

sono antigeni che derivano da proteine extracellulari internalizzate dalle APC in

vescicole endocitiche.

I linfociti T CD8 invece riconoscono gli antigeni,rappresentati da proteine citosoliche

di derivazione endogena,legati alle molecole MHC di classe I.

Per indurre una risposta T verso un antigene proteico,l’antigene deve essere

somministrato insieme a sostanze adiuvanti(sostanze di derivazione microbica di cui

svolgono la funzione) che agiscono:

-inducendo una infiammazione locale,stimolando la produzione di citochine e l’afflusso

di cellule accessorie

-attivando le cellule accessorie,aumentando l’espressione di molecole di costimolazione

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-prolungando la persistenza dei complessi MHC-peptide sulla superficie della cellula

APC

Tipi di APC

Le cellule accessorie assolvono a due funzioni fondamentali:

1) Convertono gli antigeni proteici in peptidi e li complessano con molecole MHC

self per il riconoscimento da parte dei linfociti T

2) Forniscono segnali di costimolazione ai linfociti T in seguito alla loro interazione

con il complesso MHC-peptide per una loro piena attivazione

CELLULE DENDRITICHE : presentano l’antigene ai linfociti T CD4 e CD8 e sono le più

efficaci nel dare inizio alle risposte immunitarie T-dipendenti, in quanto esprimono

costitutivamente un elevato livello di segnali costimolatori; un tipo di cellule

dendritiche sono le cellule di Langerhans, che captano l’antigene nel sottocute,

migrano nel derma e raggiungono i linfonodi secondo un processo stimolato da

chemochine, e durante la migrazione maturano ed esprimono livelli più elevati di

molecole MHC di classe II e costimolatori.

MACROFAGI : fagocitano particelle di dimensioni cospicue e sono stimolati da IFN-γ

ad esprimere MHC, in particolar modo di classe II. Intervengono nella presentazione

di antigeni derivati da agenti infettivi (batteri e parassiti).

LINFOCITI B : captano e internalizzano antigeni proteici solubili, li processano e

presentano ai linfociti T i peptidi da essi derivati.

Processazione antigene in MHC di classe I

1. PRODUZIONE DI PROTEINE CITOSOLICHE: gli antigeni estranei del citosol

possono essere il prodotto di virus o di altri microrganismi, ma sono presenti

anche molte proteine autologhe.

2. DEGRADAZIONE PROTEOLITICA DELLE PROTEINE CITOSOLIHE: le

proteine citosoliche sono degradate da un complesso enzimatico dotato di

attività proteolitica presente nel citosol, il proteasoma, che ha una specificità

di substrato molto ampia e può generare una vasta gamma di peptidi di 6-30 a.a.

3. TRASPORTO PEPTIDI DAL CITOSOL AL RE: il trasporto dal citosol al RE è

mediato dalla proteina TAP, localizzata nel RE, con trasporto attivo ATP-

dipendente; TAP è legata in maniera non covalente sul lato interno della

membrana del RE alle molecole MHC di classe I da una proteina di collegamento

detta TAPASINA.

4. ASSEMBLAGGIO COMPLESSO PEPTIDE-MHC DI CLASSE I: la catena e la

α

-microglobulina sono sintetizzate nel RE, e il ripiegamento della catena è

β α

2 Pagina 14 di 61

favorito da diverse chaperonine del RE; quando il peptide entra nel RE grazie a

TAP viene subito convogliato alla molecola MHC di classe I vuota. Il complesso

quindi si stacca dalla tapasina ed asce dal RE.

5. ESPRESSIONE DEI COMPLESSI PEPTIDE-MHC DI CLASSE I: i complessi

MHC-peptide stabili di classe I prodotti nel RE migrano nel complesso di Golgi e

da qui sono trasferiti sulla membrana cellulare su vescicole esocitiche e

riconosciute dai linfociti T CD8 specifici (CTL).

N.B: Due sono le differenza tra la processazione in classe I e II:

1)I peptidi trasportati nel RE si legano a molecole MHC di classe I e non di classe II

perché le molecole MHC di classe I sono mantenute dalla tapasina all’imboccatura del

complesso TAP.

2)La tasca dell’ MHC di classe II è occupata dalla catena invariante e non è disponibile

per legare il peptide.

Processazione antigene in MHC di classe II

1. CAPTAZIONE DELLE PROTEINE EXTRA-CELLULARI: l’antigene nativo viene

captato da una APC e internalizzato per pinocitosi o endocitosi; dopo

l’internalizzazione gli antigeni proteici si ritrovano in endosomi a pH acido, che

intersecano la via di traffico dei lisosomi.

2. PROCESSAZIONE DELLE PROTEINE INTERNALIZZATE: le proteine

internalizzato sono degradate enzimaticamente negli endosomi e nei lisosomi da

proteasi che agiscono a pH acido, generando peptidi; le proteasi più

rappresentate sono le catepsine.

3. BIOSINTESI E TRASPORTO MOLECOLE MHC DI CLASSE II AGLI

ENDOSOMI: le molecole MHC di classe II sono sintetizzate nel RE, e

l’assemblaggio delle catene e e il loro ripiegamento è favorito da

α β ,

chaperonine; nel RE queste molecole sono associate ad una catena invariante I

i

che va ad occupare la tasca di legame (è formata da 3 subunità ciascuna delle

quali va ad occupare una tasca di legame), in modo che i peptidi che devono

essere legati alle molecole di classe I presenti nel RE non si leghino alle

molecole di classe II. Durante il transito delle vescicole esocitiche verso la

superficie cellulare queste incontrano le vescicole endocitiche, contenenti gli

antigeni processati, e si fondono con esse.

4. ASSOCIAZIONE PEPTIDE-MHC II: nel MIIC gli enzimi proteolitici agiscono

su I fino a lasciare uno spezzone di 24 a.a. detto CLIP, che è sua volta rimosso

i

dalla molecola HLA-DM.

5. ESPRESSIONE DEI COMPLESSI PEPTIDE-MHC DI CLASSE II: le molecole

MHC di classe seconda sono stabilizzate dal legame col peptide, e i complessi

sono portati sulla superficie cellulare delle APC, dove sono riconosciuti dai

linfociti T CD4 (helper), i quali necessitano di riconoscere un numero di circa

100 complessi per essere attivati. Pagina 15 di 61

6. RECETTORE PER L’ANTIGENE E MOLECOLE

ACCESSORIE DEI LINFOCITI T

I linfociti T hanno una duplice specificità: riconoscono residui polimorfi delle molecole

MHC self e residui del peptide antigenico presentato dalle molecole MHC. Il

recettore che riconosce i complessi MHC-peptide prende il nome RECETTORE DEI

LINFOCITI T-TCR, ed è clonalmente distribuito, cioè cloni di linfociti T con diverse

specificità esprimono un TCR diverso.

I segnali evocati nel linfocita T sono trasdotti da proteine non polimorfiche chiamate

CD3 e che sono associate a formare il COMPLESSO CDR.

ζ,

Recettore αβ

È il recettore per l’antigene dei linfociti T CD4 e CD8 ed è un eterodimero formato da

2 catene polipeptidiche transmembrana, e legate da un ponte disolfuro. Entrambe

α β,

le catene contengono un dominio Ig variabile (V) N-terminale, un dominio Ig costante

(C), una regione idrofobica transmembrana e una breve regione citoplasmatica.

La regione V delle catene del TCR contiene 3 tratti in cui si concentra la variabilità, i

CDR, inoltre la catena contiene una quarta regione ipervariabili, sito di legame per i

β

superantigeni (prodotti microbici); la variabilità maggiore è concentrata in CDR3.

La regione transmembrana presenta a.a. di carica positiva.

Il sito di legame per l’antigene del TCR è una superficie planare formata dalle CDR

delle 2 catene. L’affinità del TCR per i complessi MHC-peptide è molto bassa, così

come il tasso di dissociazione della reazione; per questo motivo sono necessarie

molecole accessorie che stabilizzano l’adesione dei linfociti T alle APC.

Proteine CD3 e ζ

Sono associate in modo non covalente all’eterodimero del TCR. CD3 è costituito da

αβ

3 proteine, è un omodimero. Sono proteine monomorfe identiche in tutti i

γ-δ-ε, ζ

linfociti T e in tutti gli individui di una specie.

Le catene presentano un dominio Ig extracellulare, il segmento transmembrana

γ-δ-ε

un residuo negativo, che quindi interagisce con i residui positivi del segmento

transmembrana del recettore Ognuno dei domini intracitoplasmatici contiene un

αβ.

motivo conservato, la sequenza ITAM, che contiene 2 sequenze tiroxina-x-x-leucina, e

sono coinvolte nella traduzione del segnale. Pagina 16 di 61

La catena presenta una breve regione extracellulare, un dominio transmembrana a

ζ

carica negativa e una lunga coda citoplasmatica con 3 sequenze ITAM.

Il primo evento che si verifica nei linfociti T dopo il riconoscimento dell’antigene è la

fosforilazione dei residui di tirosina presenti nelle ITAM. La fosfotirosina diventa

sito di aggancio per tirosin-chinasi, la cui attivazione stimola vie di traduzione del

segnale che culminano nella modificazione e nell’espressione genica dei linfociti T.

Recettore γδ

È un secondo tipo di recettore antigenico eterodimerica espresso su una

sottopopolazione di linfociti T scarsamente rappresentati. Le catene e sono

γ δ

costituite da regioni V e C extracellulari di tipo Ig, da una regione cerniera, da un

dominio transmembrana a carica positiva e da una breve coda citoplasmatica. La

regione transmembrana interagisce con CD3. I linfociti che esprimono questo tipo di

recettore non riconoscono peptidi in associazione a molecole MHC e sono per lo più

presenti negli epiteli.

Molecole accessorie dei linfociti T

Si legano ai ligandi presenti sulle APC, sulle cellule endoteliali vascolari e nella matrice

extracellulare. Sono proteine non polimorfe che possono regolare la risposta T o

modulare la forza di adesione fra APC e linfociti T.

CD4 e CD8

Sono anche chiamate CORECETTORI (il 65% dei linfociti T esprime CD4, il 35% CD8)

e sono glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig espresse dai linfociti

T che si legano a regioni non polimorfe delle molecole MHC, quando il linfocita T si

combina con il complesso MHC-peptide delle APC; la funzione principale è quella di

trasmettere un segnale nel momento del riconoscimento antigenico (mediante la

tirosin-chinasi Lck legata alla coda citoplasmatica) e rafforzare l’adesione dei linfociti

T alle APC.

CD4 è un monomero dotato di 4 domini Ig extracellulari, una regione

transmembrana idrofobica e una coda citoplasmatica; si lega al dominio non

polimorfo delle molecole MHC di classe II mediante 2 domini Ig N-terminali.

β 2

CD8 è un eterodimero formato da 2 catene omologhe legate da ponti disolfuro,

con un dominio Ig extracellulare, un segmento transmembrana e una coda

citoplasmatica; si lega al dominio non polimorfo delle molecole MHC di classe

α 3

I mediante il dominio Ig. Pagina 17 di 61

CD28 CTLA-4

CD28 è una proteina transmembrana che trasduce segnali complementari a quelli del

complesso TCR per l’attivazione dei linfociti T vergini: il primo segnale è costituito dal

legame dei complessi MHC-peptide al TCR e ai recettori CD4 e CD8; il secondo segnale

è fornito da costimolatori.

I COSTIMOLATORI per i linfociti T sono B7-1 e B7-2, espressi dalle APC e

interagiscono con CD28, un omodimero della superfamiglia delle Ig: il suo legame a B7

trasduce nel linfocita T l’espressione di proteine anti-apoptotiche, di citochine e

inoltre favorisce la proliferazione e la differenziazione dei linfociti T.

CTLA-4 è sempre recettore per le B7 ma la sua funzione è inibire CD28,

contrastandone i segnali.

Molecole accessorie con funzione di trasmissione di segnale

CD45 : è una glicoproteine di membrana con dominio citoplasmatico tirosin-

fosfatasico. La famiglia CD45 è composta da vari componenti tutti prodotti da un solo

gene di 34 esoni; i trascritti di RNA di 3 esoni vanno incontro a splicing alternativo,

generando fino a 8 prodotti differenti. Il dominio citoplasmatico (750 a.a.) contiene

una regione dotata di attività tirosin-fosfatasica che defosforila numerosi substrati,

fra cui Lck, attivandola.

CD2 : è una glicoproteine espressa su più del 90% dei linfociti T maturi e il ligando

principale è LFA-3, espresso su cellule ematiche e non.

Integrine

Sono proteine eterodimeriche espresse sui leucociti, il cui dominio citoplasmatico è

connesso al citoscheletro; le principali sono LFA-1 e VLA. Uno dei ligandi di LFA è

ICAM-1, una glicoproteine di membrana espressa su un ampia gamma di cellule,

ematiche e non.

Mediano l’adesione dei linfociti T alle APC, alle cellule endoteliali e alle proteine della

matrice extracellulare.

Selectine Pagina 18 di 61

Sono proteine in grado di legarsi ai carboidrati delle glicoproteine espresse

sull’endotelio alto dei capillari linfonodali, e regolano la migrazione leucocitaria nei

diversi tessuti.

La L-selectina è presente a livelli elevati sui linfociti T vergini e media la loro

migrazione nei linfonodi.

SEZIONE III

7. MATURAZIONE DEI LINFOCITI ED

ESPRESSIONE DEI GENI DEL RECETTORE PER

L’ANTIGENE

La MATURAZIONE LINFOCITARIA è il processo attraverso cui i precursori

linfocitari derivati dal midollo si trasformano in linfociti maturi, e la caratteristica

centrale del processo maturativo è l’espressione dei geni del recettore per l’antigene;

l’intera gamma di recettori, espressi dai linfociti B e T, è il repertorio linfocitario.

I linfociti B maturano nel midollo osseo, i linfociti T nel timo e le fasi precoci della

maturazione sono caratterizzate da un’elevata attività mitotica stimolata da IL-7.

Ogni clone linfocitario esprime un recettore di struttura unica, sono 1 miliardo a più i

cloni linfocitari differenti, e derivano tutti da stesse sequenze di DNA che, secondo

un processo di RICOMBINAZIONE SOMATICA, vengono diversamente ricongiunte.

La ricombinazione è mediata dal complesso enzimatico RICOMBINASI V(D)J

espresso solo dai linfociti immaturi negli organi linfoidi primari; se il processo non

genera recettori funzionali il linfocita che lo esprime ma incontro ad apoptosi, difatti

meno del 10% delle cellule generate arrivano a maturazione completa.

Organizzazione dei loci Ig

Esistono 3 loci separati, ognuno su un cromosoma diverso, che codificano per la catena

leggera la catena leggera e tutte le catene pesanti. Ogni locus Ig è composto da 3

κ, λ

tipi diversi di segmenti genici V, J e C (il locus IgH possiede anche segmenti D).

All’estremità 5’ di ogni locus Ig si trova un gruppo di segmenti genici V (300 bp)

separati tra loro da tratti di DNA non codificante.

In posizione 3’ rispetto ai geni V si trovano i segmenti genici C.

Tra i geni V e C si trovano altre sequenze codificanti che formano i segmenti

genici J; nel locus della catena pesante si trovano anche i segmenti D.

Le sequenze di DNA non codificante contengono sequenze di riconoscimento che

condizionano la ricombinazione fra i differenti segmenti genici e sequenze che

regolano la trascrizione e lo splicing dell’RNA.

Ricombinazione V(D)J ed espressione dei geni delle Ig

Pagina 19 di 61

Nel linfocita B la prima ricombinazione si verifica nel locus della catena pesante e

porta al congiungimento con uno dei segmenti D con uno dei segmenti J, con

formazione del complesso D-J; a questo punto un segmento V, in posizione 5’ rispetto

a D-J, si collega a questo complesso creando V-D-J. In questa fase tutti i segmenti D

in 5’, rispetto al segmento D riarrangiato, e tutti i segmenti V in 3’, rispetto al

segmento V riarrangiato, vengono eliminati. I geni della regione C sono separati da

VDJ dal tratto di DNA che contiene i geni J più distali.

L’RNA primario viene generato per trascrizione di tutto il complesso VDJ riarrangiato

fino ai geni C; prima che l’RNA sia funzionale deve subire un processo di splicing per la

rimozione degli introni compresi fra il gene J e il gene C.

Il locus della catena pesante si riarrangia per primo su uno dei 2 cromosomi e se il

processo va a buon fine viene sintetizzata una catena che blocca il riarrangiamento

µ,

del locus della catena pesante sull’altro cromosoma mediante modificazioni nella

struttura della cromatina; se il primo riarrangiamento non è stato produttivo, i geni

della catena pesante sul secondo cromosoma possono riarrangiare: questo fenomeno,

di ESCLUSIONE ALLELICA, garantisce che ogni l linfocita B abbia una sola

specificità.

La produzione della catena stimola anche il riarrangiamento della catena leggera; il

µ

locus riarrangia per primo e se viene prodotta una catena leggera si blocca il

κ κ

riarrangiamento a livello del locus questo fenomeno, di ESCLUSIONE ISOTIPICA,

λ:

garantisce che un certo linfocita B possa produrre un solo tipo di catena leggera.

Organizzazione dei loci del TCR

I geni che codificano la catena la catena e la catena del TCR mappano in 3 loci

α, β γ

separati; il gene che codifica per la catena è situato all’interno del gene per la

δ

catena Ogni locus comprende 3 tipi di segmenti genici V, J e C (i loci e

α. β δ

possiedono anche segmenti D).

All’estremità 5’, di ognuno dei loci TCR, si trovano i segmenti genici V; i prodotti

microbici detti superantigeni si legano alla quarta CDR della regione V della

catena del TCR.

β

In posizione 3’ rispetto ai segmenti V, si trovano i segmenti genici C.

I segmenti J sono interposti fra i segmenti V e C; nei loci della catena e si

β δ

trovano anche segmenti D.

Ricombinazione V(D)J ed espressione dei geni del TCR

Nelle cellule destinate ad esprimere un TCR il locus della catena si riarrangia

αβ β

prima di quello della catena L’espressione della catena blocca il riarrangiamento

α. β

del locus della catena su entrambi i cromosomi facendo diminuire gli enzimi che

β

mediano la ricombinazione e limitando l’accessibilità dell’altro alleli agli enzimi stessi:

Pagina 20 di 61

l’esclusione allelica della catena fa si che un linfocita T maturo esprima solo uno dei

β

2 alleli della catena ereditati.

β

Il riarrangiamento della catena si può verificare su entrambi i cromosomi perché in

α

questo caso non vale la regola dell’esclusione allelica; quindi uno stesso linfocita T può

esprimere 2 TCR diversi, dotati della stessa catena e di 2 cateneα differenti.

β

Meccanismi di ricombinazione somatica dei geni del recettore

per l’antigene

Il riarrangiamento dei geni Ig e TCR coinvolge segmenti genici non omologhi ed è

mediata dagli enzimi della RICOMBINASI V(D)J, codificata dai geni RAG1 e RAG2 e

di cui fanno parte anche enzimi di riparazione del DNA presenti in molti tipi cellulari.

La ricombinasi riconosce le sequenze di ricombinazione del DNA, che sono site in 3’

rispetto ai segmenti genici V, in 5’ rispetto ai segmenti genici J e ad entrambi i lati nei

segmenti D.

Le sequenze di ricombinazione sono costituite da un eptamero, adiacente alla regione

codificante seguito da 12 o 23 nucleotidi non conservati, e da un nonamero. La

ricombinasi riconosce i le sequenze, rompe entrambi i filamenti di DNA e ricongiunge i

monconi; talvolta alcuni geni sono in orientamento trascrizionale opposto, quindi la

ricombinasi inverte l’orientamento del DNA interposto.

Diversificazione del repertorio dei linfociti B e T

DIVERSITA’ COMBINATORIA : ogni clone di linfociti B esprime nelle catene leggere

e pesanti delle Ig una combinazione di segmenti genici V, D e J assolutamente unica,

così come ogni clone di linfociti T esprime nelle catene e del TCR una combinazione

α β

V,D e J unica. Il numero di combinazioni possibili per locus è dato dal prodotto del

numero dei segmenti V, J e D, anche se il grado reale di diversità combinatoria è

molto minore rispetto alla teoria.

DIVERSITA’ GIUNZIONALE: si produce per la rimozione o l’aggiunta di nucleotidi

nel punto di unione fra V e D, fra D e J o fra V e J, mediata dall’enzima TdT. La

diversità giunzionale è responsabile delle regioni ipervariabili CDR3, alla giunzione tra

le regioni V e C. Pagina 21 di 61

Maturazione dei LINFOCITI B

1. I primi progenitori midollari sono chiamati cellule pro-B: non producono Ig ma

esprimono molecole come CD19 e CD10.

2. Le cellule che sintetizzano la catena pesante sono le cellule pre-B: una parte

µ

delle catene pesanti presenti nel citosol si associa ad una catena leggera

sostitutiva, con la formazione dei recettori pre-B che vengono espressi sulla

membrana cellulare,dove si associano con le proteine Igα e Igβ che sono

deputate a trasdurre all’interno della cellula segnali necessari a far proseguire

la maturazione.

3. Le cellule che sintetizzano le catene leggere sono i linfociti B immaturi: la

catena leggera si associa alla catena pesante e la molecola IgM completa viene

espressa sulla superficie cellulare associata alle proteine Igα e Igβ; queste

cellule non proliferano e non si differenziano in risposta all’antigene.

4. Le cellule che iniziano a coesprimere IgM e IgD sono i linfociti B maturi: sia

IgM che IgD hanno la medesima regione V, quindi la medesima specificità;

queste cellule sono funzionali e lasciano il midollo osseo per entrare negli organi

linfoidi periferici.

5. Una volta stimolati dagli antigeni e da altri segnali i linfociti B maturi sono

definiti linfociti T attivati, che proliferano e sintetizzano Ig in forma secreta.

Parte della progenie dei linfociti T attivati va incontro a scambio isotipico

esprimendo catene pesanti differenti, altri linfociti si trasformano in cellule

della memoria.

6. La differenziazione indotta dall’antigene nei linfociti B vergini o della memoria

culmina nello sviluppo delle cellule secernenti anticorpi, o plasmacellule.

I componenti di ogni clone di linfociti B esprimono sempre la stessa regione V,

mantenendo la stessa specificità antigenica, ma nel corso della risposta all’antigene si

verificano minime modificazioni a carico della regione V degli anticorpi secondo un

processo noto come MATURAZIONE DELL’AFFINITA’.

All’interno dei linfociti B esiste una sottopopolazione, denominata B-1, che esprime

sulla membrana la molecola CD5 (5% linfociti in circolo); si trovano in gran numero a

livello peritoneale e secernono IgM contro polisaccaridi microbici o antigeni self;

tutte le leucemie linfatiche croniche B derivano da linfociti B CD5. Pagina 22 di 61

La SELEZIONE NEGATIVA è il processo secondo il quale linfociti B immaturi che

esprimono recettori ad elevata affinità per antigeni autologhi vanno incontro o ad

apoptosi o restano non funzionali.

Alcuni linfociti B immaturi che riconoscono gli antigeni autologhi possono essere

indotti a modificare la propria specificità tramite un “editing recettoriale”, con la

produzione di una nuova catena leggera e con la conseguente espressione di un diverso

recettore Ig non autoreattivo.

Maturazione dei LINFOCITI T

I linfociti T originano da precursori del midollo osseo che maturano nel timo, e qui

sono detti timociti. Gli stimoli necessari per la proliferazione e la maturazione

arrivano da cellule epiteliali timiche, da macrofagi e da cellule dendritiche e sono

costituiti da molecole MHC e da citochine: nella corticale del timo le cellule esprimono

MHC di classe II, nella midollare sia MHC di classe I che di classe II; la più

importante citochina è IL-7. Il tasso di proliferazione e apoptosi dei timociti della

corticale è molto elevato, difatti il 95% della progenie di un singolo precursore va in

apoptosi prima di raggiungere la midollare.

1. I timociti più immaturi non esprimono né TCR né CD4 o CD8, e sono detti

timociti doppio-negativi, che si trovano nello stadio pro-T.

2. Lo stadio pre-T è caratterizzato dall’espressione del complesso pre-TCR,

costituito dalla catena del TCR in associazione ad una catena pre-Tα e dalle

β

proteine CD3 e implicato in un meccanismo di traduzione del segnale che

ζ,

permette alla maturazione di proseguire.

3. Nello stadio successivo i timociti esprimono sia CD4 che CD8, per questo

vengono detti timociti doppio-positivi: in questo stadio viene espresso il TCR

completo associato alle proteine CD3 e queste cellule sono responsive agli

ζ;

antigeni e vanno incontro ai processi di selezione positiva e negativa.

4. Le cellule che sopravvivono ad entrambi i processi selettivi diventano timociti

singolo-positivi, esprimenti solo CD4 o solo CD8.

Le cellule T che esprimono catene e funzionali non esprimono un TCR e

γ δ αβ

viceversa; questa sottopopolazione è simile alla B-1 per i linfociti B, e anche se

possiede una diversificazione limitata, potrebbe funzionare come primo argine di

difesa contro un numero limitato di microbi a larga diffusione, incontrati a livello della

barriere epiteliali.

La SELEZIONE POSITIVA è il processo secondo il quale i timociti dotati di un TCR

che si lega debolmente ai complessi MHC-peptide autologhi vengono stimolati e

sopravvivono, mentre i timociti il cui TCR non è in grado di riconoscere tali complessi

vanno incontro a morte; questo processo condiziona anche la restrizione per classe I e

classe II (educazione timica). Pagina 23 di 61

La SELEZIONE NEGATIVA è il processo secondo il quale i timociti dotati di un TCR

che si lega con avidità ai complessi MHC-peptide autologhi vengono uccisi.

8. ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI T

Il riconoscimento dei complessi MHC-peptide da parte del TCR è il presupposto della

specificità della risposta T. I corecettori CD4 e CD8 interagiscono con le molecole di

classe II e I, e trasmettono segnali attivatori all’interno dei linfociti.

Le molecole di adesione, come le integrine, stabilizzano l’adesione dei linfociti alle APC

affinché l’interazione sia abbastanza lunga per permetter l’avvio della risposta T:

l’affinità dei TCR per i complessi MHC-peptide è molto bassa, il contatto medio

avviene per meno di 10 secondi. L’attivazione richiede che i TCR si impegnino

ripetutamente con i complessi, fino ad un accumulo di segnali che porta al

raggiungimento di una soglia critica; le cellule T effettrici e della memoria hanno una

soglia di attivazione inferiore rispetto ai linfociti T vergini.

La risposta dei linfociti T è influenzata dalla natura delle APC, ad esempio le cellule

dendritiche mature esprimono elevati livelli di molecole MHC e di molecole

costimolatorie che forniscono il secondo segnale.

I linfociti T effettori CD4 secernono numerose citochine, in particolare IL-2, e

aumentano l’espressione dei recettori per le citochine stesse, secondo un fenomeno di

CRESCITA AUTOCRINA. Le citochine agiscono anche sui linfociti B, sui macrofagi sui

granulociti e sulle cellule endoteliali. I linfociti T helper attivati esprimono anche il

ligando di CD40, che interagisce con l’antigene CD40 dei linfociti B e dei macrofagi

attivandoli.

Quando l’antigene viene eliminato le risposte T via via declinano perché i linfociti

vengono privati degli stimoli alla sopravvivenza forniti dall’antigene, dei fattori

costimolatori e delle citochine.

Parte della progenie dei linfociti T stimolati dall’antigene si differenzia in cellule della

memoria, che sopravvivono per periodi molto lunghi e si accumulano con l’età; i linfociti

T della memoria esprimono elevati livelli di integrine e CD44, che favoriscono la

migrazione di queste cellule nei focolai periferici di infezione e infiammazione e ne

garantiscono la permanenza in tali siti. Pagina 24 di 61

Ruolo delle molecole costimolatorie

Il primo segnale è trasmesso dal legame dell’antigene al relativo recettore, il secondo

segnale è fornito da molecole espresse sulle APC e denominate COSTIMOLATORI. In

assenza di segnali costimolatori le cellule T o muoiono o entrano in uno stato di

ANERGIA:

CD28 potenzia la capacità di sopravvivere, la produzione di citochine e la

• differenziazione da cellule vergini ad effettrici;

B7-1 e B7-2 sono 2 glicoproteine Ig espresse su APC professionali, la cui

• espressione può essere indotta da endotossina microbica, citochine o il legame

CD40L.

Le cellule dendritiche mature esprimono i livelli più elevati di molecole costimolatorie,

ma molto importanti sono anche gli ADIUVANTI, sostanze di derivazione microbica o

che ne mimano l’attività la cui funzione è incrementare l’espressione di costimolatori

sulle APC.

Trasduzione del segnale

Ras e Rac

Il riconoscimento dell’antigene avvia all’interno dei linfociti T una cascata di segnali

biochimici che portano alla trascrizione di numerosi geni e all’attivazione della cellula.

L’interazione del linfocita T con i complessi MHC-peptide espressi sulle APC provoca

l’aggregazione dei complessi TCR e dei corecettori CD4 e CD8 in aree ristrette,

localizzate nel punto di contatto:

Lck, una tirosin-chinasi associata alla coda citoplasmatica di CD4 e di CD8, si

• avvicina alle ITAM delle catene CD3 e della catena e una volta attivata ne

ζ,

fosforila i residui tirosinici;

alle ITAM fosforilate si aggancia la tirosin-chinasi ZAP-70, che viene a sua

• volta fosforilata da Lck;

ZAP-70 fosforilata acquisisce un’attività tirosin-chinasica, e fosforila LAT, che

• recluta proteine adattatrici, tra cui Grb-2, che attiva uno scambiatore GDP-

GTP chiamato Sos;

le molecole Ras sono proteine in grado di legare GTP, associate debolmente alla

• membrana plasmatica, e nella forma inattiva legano GDP; lo scambio con GTP

causa modificazioni conformazionali in Ras, conferendogli la capacità di

attivatore allosterico su numerosi una cascata di enzimi, le chinasi MAP;

Pagina 25 di 61

la via delle chinasi MAP attiva l’enzima ERK, che fosforila Elk; Elk stimola la

• trascrizione di Fos, il primo componente del fattore di trascrizione AP-1.

Le molecole adattatrici fosforilate dalle chinasi associate al TCR attivano anche una

proteina scambiatrice GDP-GTP chiamata Vav, che agisce sulla molecola Rac: Rac-GTP

innesca una cascata MAP che attiva la chinasi JNK, che fosforila c-Jun, il secondo

componente del fattore di trascrizione AP-1.

Calcineurina e PKC

La trasduzione del segnale porta all’attivazione della PLC, che catalizza la scissione di

un fosfolipide di membrana in IP e DAG:

3

: diffonde nel citosol fino al RE e stimola il rilascio degli ioni calcio nel citosol,

IP 3

inoltre si apre un canale del calcio con conseguente afflusso di ioni calcio anche

dall’esterno; il calcio si lega alla calmodulina, e il complesso attiva la calcineurina,

importante per l’attivazione di fattori di trascrizione.

DAG : attiva la PKC, presente in corrispondenza della membrana plasmatica, il cui sito

catalitico diventa accessibile a diversi substrati.

Le differenti vie di trasduzione del segnale attivano fattori trascrizionali diversi:

NFAT : necessario per l’espressione dei geni di IL-2, IL-4, TNF e altre

citochine;

AP-1 : è composto dalle proteine Fos e Jun, con l’avvio della trascrizione del

gene Fos e la fosforilazione di proteine Jun gia presenti nel citosol;

NF-κB : essenziale per la sintesi di citochine.

I costimolatori possono attivare vie separate di trasduzione di segnale che possono

convergere o meno con quelle innescate dal TCR. Pagina 26 di 61

9. ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI B

Riconoscimento dell’antigene

Il BCR, recettore per l’antigene dei linfociti B, trasmette all’interno della cellula un

segnale di attivazione quando due o più molecole vengono aggregate da parte di un

antigene multivalente. Le IgM e le IgD di membrana hanno una coda citoplasmatica di

3 a.a. (lisina, valina, lisina) che è troppo corta per trasdurre il segnale, proprio per

questo sono associate alle molecole Igα e Igβ, che contengono sequenze ITAM nei

domini citoplasmatici. L’aggregazione delle Ig avvicina le sequenze ITAM con il

conseguente innesco della cascata di trasmissione del segnale:

la protein-chinasi Syk si lega ai residui fosforilati delle sequenze ITAM di Igα

• e Igβ, si attiva mediante fosforilazione e a sua volta attiva la PLCγ1;

e DAG: IP promuove un

PLCγ1 scinde un fosfolipide di membrana in IP

• 3 3

innalzamento dei livelli di calcio citoplasmatico, che causa una traslocazione di

PKC a livello della membrana; DAG attiva la PKC che fosforila altre proteine.

Anche Ras viene attivata dall’aggregazione delle Ig, e questo provoca l’attivazione

della cascata delle chinasi MAP.

Tutele cascate di segnale hanno come fine ultimo l’attivazione dei fattori di

trascrizione che inducono l’espressione di geni indispensabili per l’attivazione B.

L’aggregazione del BCR da parte dell’antigene stimola il linfocita B: ad entrare in G ,

1

ad accendere geni anti-apoptotici, ad esprimere MHC II e B7-2 e B7-1, ad aumentare

l’espressione di citochine di derivazione T.

Secondi segnali

L’attivazione B richiede anche secondi segnali, che posso no essere trasmessi dalle

proteine del complemento: un prodotto proteolitico del complemento, C3d (prodotto

dalla proteolisi di C3 e che si lega a microbi o a complessi antigene-anticorpo che

Pagina 27 di 61

hanno attivato il complemento) si lega al recettore CR2 dei linfociti B, un complesso

trimolecolare noto come complesso co-recettoriale dei linfociti B; questo legame

potenzia le vie di trasduzione del segnale.

Risposta anticorpale dipendente da linfociti T helper

La risposta anticorpale agli antigeni proteici richiede il riconoscimento dell’antigene da

parte dei linfociti T helper e la cooperazione fra linfociti T e B specifici per

quell’antigene. I linfociti B riconoscono l’antigene a livello dei follicoli linfatici, vengono

attivati e cominciano a migrare verso le aree T, e incontrano i linfociti T a limite fra

follicoli e aree T; l’interazione B-T dipende dal riconoscimento dell’antigene e anche

dall’interazione di numerose molecole di superficie espresse dai 2 tipi cellulari.

I linfociti B specifici captano l’antigene tramite le Ig di membrana, lo processano e lo

presentano ai linfociti T helper CD4 in associazione a molecole MHC II, assumendo la

funzione di APC. I diversi peptidi di una stessa proteina, presentati dai linfociti B

associati alle MHC II a linfociti T helper diversi, inducono comunque una risposta

anticorpale verso la proteina nativa.

Il legame dell’antigene alle Ig di membrana potenzia l’espressione di molecole

costimolatrici, come B7-2 e B7-1) che aumentano la capacità dei linfociti B di attivare

le cellule T helper. I linfociti T helper attivati esprimono CD40L, che interagisce con

CD40 presente sui linfociti B e provoca il reclutamento delle proteine citoplasmatiche

TRAF, le quali innescano una cascata enzimatica che attiva numerosi fattori di

trascrizione.

I linfociti T helper attivati secernono citochine che potenziano le proliferazione e la

differenziazione dei linfociti B; citochine diverse inducono stimoli diversi e la loro

azione può essere sinergica o antagonista.

Parte dei linfociti B che hanno proliferato si differenziano in cellule secernenti

anticorpi: gli anticorpi di membrana e gli anticorpi secreti differiscono per la

composizione della regione C-terminale, e il passaggio dalla forma di membrana a

quella di secrezione è il risultato di una diversa processazione dell’mRNA della catena

pesante. Molte cellule B che secernono anticorpi si differenziano in plasmacellule,

destinate ad una massiccia produzione anticorpale. Pagina 28 di 61

Parte dei linfociti B attivati va incontro allo scambio dell’isotipo della catena pesante,

con conseguente produzione di anticorpi di classe diversa; questo fenomeno è

stimolato da citochine prodotte da sottopopolazioni differenti di linfociti T helper. Il

meccanismo alla base dello scambio di classe è la ricombinazione per scambio: il

segmento genico VDJ si collega ad un gene C più a valle di quello a cui era ricombinato

e segmento di DNA interposto viene eliminato.

Dopo 4-7 giorni dalla stimolazione alcuni linfociti B migrano più in profondità nel

follicolo e formano un centro germinativo, che contiene cellule derivate da un solo

linfocita; la progenie va poi incontro a processi di selezione e diversificazione, anche

grazie alle cellule follicolari dendritiche, che esprimono molecole stimolanti i linfociti

B immaturi (recettori per il complemento, per Fc, CD40).

MATURAZIONE DELL’AFFINITA’ : mediante un processo di ipermutazione somatica

i linfociti B proliferanti, all’interno del centro germinativo, mostrano un alto tasso di

mutazioni a livello dei geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle Ig; tali

mutazioni hanno lo scopo di generare anticorpi a maggiore affinità per l’antigene,

perchè man mano che l’antigene viene eliminato sopravvivono selettivamente solo quei

linfociti che presentano un’affinità sempre più elevata e che possono anche

differenziarsi in plasmacellule.

LINFOCITI B DELLA MEMORIA : acquisiscono la capacità di sopravvivere per lunghi

periodi e sono capaci di generare una rapida e più potente risposta umorale in caso di

riesposizione all’antigene; posseggono un BCR permutato ed esprimono un solo isotipo

Ig; possono rimanere nel linfonodo o stanziarsi in altri tessuti linfoidi.

Risposta anticorpale agli antigeni T-indipendenti

Molti antigeni non proteici, come i polisaccaridi e i lipidi, denominati antigeni timo-

indipendenti (TI), stimolano la produzione di anticorpi in assenza dei linfociti T helper.

Gli anticorpi prodotti in assenza di cooperazione T hanno una bassa affinità e sono

rappresentati da IgM; la generazione di cellule della memoria è scarsa.

Molti polisaccaridi attivano il sistema del complemento per la via alternativa (la via

classica prevede l’interazione con molecole di anticorpo legate all’antigene) generando

C3d che si lega all’antigene e può fungere da secondo segnale.

Feedback anticorpale

Consiste nell’inibizione della sintesi di anticorpi da parte degli stessi anticorpi

prodotti. Gli anticorpi IgG formano un complesso con l’antigene e questo complesso si

Pagina 29 di 61

lega a recettori Fcγ, che presentano una coda citoplasmatica con una sequenza ITIM

che avvia una cascata enzimatica che termina con lo spegnimento della risposta

all’antigene (l’impegno simultaneo delle Ig e dei recettori Fcγ espressi sulla membrana

dei linfociti B ne inibisce l’attivazione).

10. TOLLERANZA IMMUNOLOGICA

È uno stato di non responsività ad un antigene indotto da una precedente esposizione a

quello stesso antigene e gli antigeni in grado di indurre tolleranza sono chiamati

TOLLEROGENI.

La tolleranza centrale si verifica perché tutti i linfociti, nel corso della loro

maturazione negli organi linfoidi primari, passano attraverso uno stadio in cui

l’incontro con l’antigene porta alla tolleranza e non all’attivazione, ma gli unici antigeni

presenti in tali organi a concentrazione elevata sono antigeni self.

La tolleranza periferica si genera grazie al riconoscimento degli antigeni in assenza di

un livello adeguato di costimolazione o grazie ad una persistente e ripetuta

stimolazione per opera degli antigeni autologhi a livello dei tessuti periferici.

Tolleranza dei linfociti T

La tolleranza dei linfociti T helper previene risposte immunitarie verso gli antigeni

proteici perché questi linfociti sono necessari sia per indurre risposte cellulari che

umorali verso questi antigeni.

Le proteine autologhe sono processate e presentate da APC timiche coniugate a

molecole MHC, ma i linfociti T immaturi che riconoscono complessi MHC-antigene

autologhi ad alta affinità vanno incontro ad eliminazione, quindi i linfociti T maturi che

lasciano il timo per andare nei tessuti linfoidi periferici sono tolleranti verso gli

antigeni self espressi o presenti nel timo.

Se i linfociti T helper riconoscono un peptide presentato da APC che non esprimono

molecole costimolatorie entrano in uno stato di anergia. Lo stato di anergia si instaura

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flaviael

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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti completi di Immunologia del professor Abbate con analisi dei seguenti argomenti: le risposte immunitarie, cellule e tessuti del sistema immunitario, anticorpi e antigeni, complesso maggiore di istocompatibilità, l'antigene ai linfociti T, recettore per l'antigene, maturazione e attivazione dei linfociti, tolleranza immunologica, le citochine.


DETTAGLI
Esame: Immunologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - durata 6 anni) (CASERTA, NAPOLI)
SSD:

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher flaviael di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Seconda Università di Napoli SUN - Unina2 o del prof Abbate Gianfranco.

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