Controllo epigenetico dell'espressione genica - Appunti

MACCHINARIO TRASCRIZIONALE

INTERAZIONE TRA FATTORI PROTEICI E DNA IN MANIERA SEQUENZA-SPECIFICA

• ACCESSO AL DNA NON DIRETTO -> ORGANIZZAZIONE IN CROMATINA -> TALE STRUTTURA COMPATTA DEVE ESSERE MODIFICATA PER RENDERE ACCESSIBILE INFORMAZIONE -> RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA SI BASA SU UN CAMBIAMENTO DELL'ORGANIZZAZIONE DEGLI ISTONI (MODIFICHE DI SPOSTAMENTO/POSIZIONAMENTO) = RIMODELLATORI CONSENTONO ACCESSO REGIONI SPECIFICHE
• 3 COMPONENTI PRINCIPALI CHE VENGONO ALTERATI
  • MODIFICAZIONI DEL DNA: ALTERAZIONE DI SPECIFICHE BASI (CITOSINA)
  • MODIFICAZIONI NELLA CROMATINA
  • REMODELING MACHINES
• PRINCIPALI COMPONENTI DELLA REGOLAZIONE EPIGENETICA = EVENTUALE INTERVENTO DNA NON CODIFICANTE

MODIFICAZIONI DEL DNA

METILAZIONE DNA

• CONSISTE NELL'AGGIUNTA DI UN METILE AL 5' DELLA CITOSINA = 5'-METILCITOSINA
• METILE = UN MARCATORE RICONOSCIUTO DA VARI ELEMENTI, MODIFICA AVVIENE GRAZIE ALLA DNA-METIL-TRANSFERASI
• S-ADENOSIL-METIONINA = PRECURSORE DETERMINANTE

• DISTRIBUZIONE METILAZIONE SU DNA NON È UNIFORME - SEQUENZE RIPETUTE SONO SOLITAMENTE IPERMETILATE (LE LINE/MINISATELLITI HANNO METILAZIONE VARIABILE) LE SEQUENZE UNICHE, CHE SONO GENERALMENTE NON RIPETUTE, MAI METILATE.
• REGIONS DEI PROMOTORI NON METILATI, REGIONI CODIFICANTI PRESENTANO PROMOTORI METILATI.
• DISTRIBUZIONE DNA METILATO IN EUCARIOTI NON È UNIFORME = 80% DELLA METILAZIONE DEL DNA È A CARICO DI CITOSINE RAGGRUPPATE IN REGIONI NOTE COME CPG ISLANDS = GENI SOSTITUTIVI HANNO UN CERTO TASSO DI METILAZIONE CON SCARSA PRESENZA DI CPG ISLANDS; I GENI RICCHI DI CPG SONO PRESENTI.
• CGP ISLANDS SONO SEQUENZE DI 200 BP CON >50% DI C-G

• VARIAZIONI METILAZIONE CARICO DEI PROMOTORI DEI GENI LA CUI ESPRESSIONE INDUCIBILE NON È RAPPRESENTA = SILENZIAMENTO VIENE AL GENE.
• SE CPG ISLANDS DI PROMOTORI È METILATA È REPRESSIVA; TRASCRIZIONALI POSSONO LEGARSI E REGOLARE NEGATIVAMENTE ESPRESSIONE GENICA TRAMITE IMPLEMENTO TGF BETA.
• REGIONS POLIMERASI PERMETTENDO RICORSISUONANDO SCARTO DI REGIONI NORMALMENTE ATTIVE, MODIFICA RADICALE INTERVENTO CODIFICANTI METILATA, DNA POLIMERASI PUÒ SOSPENDERE O INIBIRE. PROMOTORI NON AMBIATA MA SOPRATTUTTO CPG DIP GENE.
• TRASPOSMICOSI SONO SPESSO METILATE = INANIMAMENTO IN MODO DA PREVENIRE FENOMENI RICOMBINANTI E TRASPOSONI. DNA INTERVENTO CARRATTI; C FU RAPIDAMENTE (DA MG) MAGGIORE STABILITÀ AL REGIONI ORGANICHE STABILITÀ SEQUENZE TRASPOSONICHE = METILAZIONE.
• GENI SILENCED = INGRESSO SOPRATTUTTO GENI CHE DEVONO ESSERE SILENCIZZATI = INATTIVAZIONE CROMOSOMA X

LA TRANSIZIONE C = T È FORTEMENTE FAVORITA ALLA METILAZIONE; TALE EVENTO PUÒ ACCUMULARSI E, SE PRESENTE IN REGIONI CODIFICANTI IMPORTANTI, PUÒ PORTARE AD ACCUMULO MUTAZIONI CHE CAUSANO.

• STUDIANDO DISTRIBUZIONE DI METILAZIONE SI È VISTO CHE REGIONI ESONICHE PRESENTANO MOLTEPLICI DI METILAZIONE; TALVOLTA SI POMMETTE DI REGOLARE SPLICING ALTERNATIVO IN MANI POLICARE. È STATO VISTO CHE REGIONI SPLICING ALTERNATIVO SONO DIFFERENTEMENTE METILATI.
• REGIONS METILATA
• ALLINEAMENTO MICOSI DELLA RNA POLIMERASI PERMETTENDO RICONISCONDO SCARTO DI REGIONI NORMALMENTE INTRONICHE TRASPOSTONE INTERVIENE CODIFICANTI FATTORI PROTEIN CI OPP-REGOLAZIONE INTERVENENDO IN MODO POSITIVO O NEGATIVO LA DISPONIBILITÀ DELLA SEQUENZA.

• UNA SERIE DI FATTORI DI TRASCRIZIONE POSSONO ESSERE INIBITI DALLA PRESENZA DI REGIONI METILATA SU PROMOZ.
• AD ESEMPIO: C-MYC, SP1, C/EBP, NF-KB
• LE REGIONI METILATA PUÒ ANCH É RICHIAMARE UNA SPECIFICA REPRESSIONE TRASCRIZIONALE = STATO EREDITABILE E ORGANISME NE LE PROTEINE CHE LEGANO DNA METILATO DENOMINATO MBD (METHYL BINDING DOMAIN)

UNA DELLE PROTEINE PIU’ IMPORTANTI E’ MECP2 → SE GENE DI TALE PROTEINA E’ MUTATO SI HA LA SINDROME DI RETT (SOLO NELLE BAMBINE).

QUANDO ANTROPOLOGICO FUNZIONA → MUTAZIONE DOMINANTE LEGATA AL SESSO UMANA. PROTEINA MECP2 È IN GRADO DI LEGARE SEQUENZE TELOMERICHE E CENTROMERICHE ALTAMENTE METILATE UNENDO GENE ‘E’ PROMOTORE SOGGETTO IN COMPLESSO SIMIL-8.

MECP2 ESISTE INDIRETTAMENTE CON COMPLESSO SIMIL-8. MECP2 SI ASSOCIA IN COMPLESSI SIN3A e N-COR (CO-REPRESSORI) → RUMOR A REPRESSORE TRASCRIZIONALE LEGGANDOSI A REGIONI METILATE E RICHIAMANDO COMPLESSO SIN3A CHE DEACETILA GLI ISTONI DANDO VIA DI SILENZIAMENTO E FOSFORILAZIONE. MECP2 PORTA AD UNA SUA INATTIVAZIONE.

S-ADENOSIN METIONINA → (PRECUSORE)

CITOSINA → METITESIONE DNA METIL. TRANSFERASI

→ (ENZIMA CHE CATTURA METILAZIONE)

• DIFFERENTI TIPI DI DNA METIL-TRANSFERASI (DNMT)
  • DNMT1 → ENZIMA DI MANTENIMENTO AL MOMENTO DELLA REPLICAZIONE, DNMT1 MANTIENE LA METILAZIONE SU NUOVI COPPI DI DNA CHE NON E’ ANCORA METILATTA E AGISCE COPPIA CON MOLECOLE MONOPEPTIDICHE SUL SUBSTRATO (EMETTIZZANTI)
  • DNMT3A (0B) → “DE NOVO” E’ COSTITUITO DA SUBUNITÀ PRINCIPALI E UNA SUBUNITÀ ACCESSORIA (HAO) CHE DEACTILA ISTRUTURA. (36)
• SOTTRATI MOLTO SIMILI → SOTTRATTO DEL DNA-DNMT3
• → SOTSTRATO NELLA DNA IST. FAVORISCONO MODIFICHE ISTONICHE (NE) CONTINUANO METILAZIONE HANNO FAVOREVOLI SU CCUCCINE CON SU H3-K4. ISTON ESISTONO MODIFICHE ISTONICHE (CC) INDICATE A NUCLEOSOMA.

MODIFICAZIONI ISTONI

ATTENZIONE SULL’LE MODIFCHE DEGLI ISTONI RISALVE A ANNI 90.

MODIFICAZIONI SU H3, H4, H2A, H2B SONO PIU STUDIATE, IN QUANTO A CARICO DI SEQUENZE CONSERVATE (CHIA PRESENTA SEQUENZA UNIVERSALE) SONO STATI AGGIUNTI GRUPPI MOLTO PICCOLI COME METIL E ACETILE, MA ANCHE GRUPPI FOSFATO SU UBIQUITINA.

ISTON DISTINTIVO CON FORTE INSORGENZA DI GRUPPI FOSFATO. GRUPPI FOSFATO O NATTURA ARGININA → ACETILE NATTI ACETINANO LE CARICHE DI LISINA E ARGININA.

WRITERS → ENZIMI CHE AGGIUNGONO UN SEGNALLE SU  CHROMATINA

READERS → PROTEINE CHE LEGANO E INTERPRETANO' SEGNALLI SU CROMATINA

ERASERS → ENZIMI CHE RIMUOVONO UN SEGNALLE SU CROMATINA

• MODIFICAZIONI EPIGENETICHE CHE SONO REVERSIBILI (AL CHE CONTRARIO DI MODIFICHE GENETICHE)
  • DOMINI READERS → DOMINIO BROMODOMINIO CROMODOMINIO CCC
• LISINA PUÒ ESSERE
  • ACETILATA / DIACETILATA → HAT/HDAC
  • METILATA / DEMETILATA → HMT/HDM
  • UBIQUITINATA / DEUBIQUITINATA → LIGASI/UB PROTEASI
• SERINA E TREONINA PUO’ ESSERE → FOSFORILATA → CHINASI/PHOSFATASI
• ARGININA PUO’ ESSERE → METILATA/DEMETILATA → PRMT
• PROTEINE DEDICATE A MODIFICHE ATTSTONI POSSONO ESSERE ASSOCIATI A RNA O FATTORI IN RISACRIZIONE. AGGISCONO COME CO-REGOLATORII’ TRASCRIZIONALI, TRASOLE AL CO-REPRESORI.

HDACS (IPO) MUTAZIONE HATS

• MODIFICAZIONI ISTONICHE POSSONO RICHIAMARE DETERMINA FATTORI PROTEICI CHE CONOSCONO MODIFICHE APPROCCIATO A CHROMATINA.

(3) CHD :

• Complessi multimerici
• Altera spazionamento nucleosomi ma anche assemblaggio cromatina
• Permette fenomeni di sliding del nucleosoma
• Possiedono una componente ATPasica
• Complessi nucl che contengono proteine di legame al DNA metilato
• Ha principalmente funzione repressiva
• Presenza comodomini consente legame a lisine metilate

(4) INO80 :

• Molto conservato in vari organismi
• Può agire su sliding e sostituzioni
• Promuove il repair di varie istoniche integrasco con H2AX-P
• Assocato come factor al DNA in trascrizione
• Ha dominio elicasico, ATPasico e legame a fattori trascrizione
• INO80 può avere funzione nella replicazione in assenza di INO80 la replicazione avviene

Organizzazione ad anse

• Dominio cromatinico - Porzione di genoma, all'interno del quale sono presenti frammenti di DNA con caratteristiche o sequenze simili ai lati del dominio sono presenti degli isolatori, che hanno l'importante funzione di separare.
• Dominio euromatonico = Dominio funzionale
• Isolatori sono trovano anche all'interno di un dominio → Isolatori costituiscono, spesso, un "blocco" nell'interazione tra due entità
• Si pensa che isolatori siano terminali ai punti di aggregazione della cromatina, si forma una sorta ai nucleosomal di agli altri domini
• Formazione di anse mediata da isolatori potrebbe consentire anche attivazione di enhancer

Uno degli elementi costitutivi del dominio è la proteina CTCF scoperta inizialmente come fattore trascrizione in una regione centrale oncogene ai sottodomini di Zn Finger e tali regioni consentono l'interazione di una sequenza consensus di circa 42 bp

• CTCF si trova assiciata spesso a fattori che interagiscono con gli isolatori, e una proteina ubiquitariamente e distinta dalle altre CTCF ad anse predittore del rischio
• Tra le attività più importanti di CTCF vi è l'organizzazione ad anse nel visualizzazione DNA (topologia nucleare tra organismi mammari mammiferi) in Xenopus tramite fluorescenza l'anone ma DNA si medeisgna espellendo episodi o tal vedi visibile come "tami" DNA
• Si osserva DNA senza elementi ad esso associati scheletro nucleare o matrice nucleare → inucle esistonizzati o trattai ad agenti interagarchi (ETBR) e se elica e interrotta (passa) non aumenta con aumento EB (EB minima) . se no plasmidi → non legame valore del massimo
• Nei plasmidi se dominio circolare, DNA è chiuso, aumento di EBms causa prima rilassamento del superavvolgimento negativo e poi (aumenti) concentrazione induce supercoiling

Organizzazione ad anse

→ Il livello di strutturazione complesso che vede DNA ancorato ad un' impalcatura, un supporto di natura essenzialmente non istonica

• Organizzazione anse è principio fondamentale del genoma su struttura (non nel nucleode batterico il studio sedimentazione avvicinando sua struttura (NO impossivirus visualizzare ma gamma che ho utilizzate per la depolimerizzazione della parte mRNA component proteiche → studio sedimentazione hota collina campana inversa NACA presentano strutture in anse superavvolgimento sono facilmente visibile nel cromosoma batterico
• Gli elementi di ancoraggio delle anse nel nucleoli batterico sono noti e definiti, e batterie (organizzato envelope ports una proteine iston-simili Eco E coli)
• Non è chiara la rilevanza dell'taminae nel nucleoide unico
• Il nucleoide desensell, organizzazione strutturale e distribuzione fattori associati differente se batterio, in fase di crescita o stazionari

Matrice nucleare e nucleoscheletro (scaffold)

• (Contesto morfologico complesso) - (Complessi biokhumi → nuclease POSA)
• Responsabile del mantenimento della struttura del DNA

Per isolare matrice nucleare necessario lisiare le cellule recuperare nucleo

Rimuovere gli istoni ottengo una frazione soluzione delle matrici nucleari, se quest'ultime posso attuare purificazione dna si ottiene DNA solubile e nucleoscheletro