Appunti di Virologia

RNA.

Il dsRNA subisce un processo di interazione con proteine TRBP, dicer, RISC (RNA

interference specificity complex).

1. DsRNA scisso da enzima dicer in frammenti di siRNA.

2. L’endonucleasi Ago 2 catalizza la denaturazione del duplex siRNA. Svolto il

filamento, quello guida viene incorporato nel complesso di specificità

dell’interferenza dell’RNA (RISC), mentre il filamento passeggero viene

rilasciato.

3. RISC utilizza il filamento guida per trovare l’mRNA del virus che ha una

sequenza complementare e quindi portando alla scissione endonucleolitica

dell’mRNA bersaglio, inibendo la traduzione del virus.

La maggior parte delle piante ha più di un gene DICER.

- Silenziamento sistemico: il silenziamento di un virus può diffondersi

sistematicamente in tutta la pianta dopo l’induzione nella cellula inizialmente

infettata. Il siRNA può diffondersi attraverso i plasmodesmi con o prima del virus. La

RNA polimerasi RNA dipendente dell’ospite amplifica il siRNA (a doppio filamento)

per dare forme dsRNA, poi trasformate in siRNA secondari. Questi poi vengono

spostati e amplificati. Può seguire poi la diffusione vascolare. Questo movimento

sistemico è più veloce del movimento virale e innesca la risposta difensiva prima

dell’arrivo del virus.

- Soppressione del silenziamento: virus e viroidi hanno sviluppato strategie per

sopprimere il silenziamento dell’RNA, mediante alcune proteine o acidi nucleici.

Molti prodotti genici virali sono identificati come soppressori del silenziamento.

Queste proteine hanno anche altre funzioni (il CTV ha più prodotti genici coinvolti

nel silenziamento). In genere le proteine si legano ai siRNA, altri ai dsRNA prima

dell’azione del DICER, impedendo il funzionamento del RISC. I viroidi non

codificano proteine, ma ci sono siRNA specifici per loro, ma la loro struttura

secondaria può sopprimere il silenziamento. Alcuni virus si replicano in siti

inaccessibili (vescicole) per evitare i sistemi di difesa della cellula ospite, inoltre

incapsidandosi velocemente possono superare il sistema di difesa.

Il silenziamento e la soppressione del silenziamento hanno influenza sui sintomi del virus. I

sintomi si verificano per un equilibrio tra i due fenomeni in quanto se uno dei due fosse

completo non ci sarebbero sintomi o la pianta morirebbe. Comunque, la rapida morte della

pianta è uno svantaggio per il virus. Se non ci fosse la soppressione del silenziamento il virus

non sarebbe in grado di stabilire un'infezione.

- Geni R di resistenza nelle piante: il riconoscimento del patogeno da parte dell’ospite

avviene attraverso l’interazione proteina-proteina, i prodotti del gene R della pianta

interagiscono specificatamente e direttamente con le proteine del virus. Questa

interazione permette l’inizio di eventi fosforilativi che porta alla trascrizione di geni

della pianta e alla risposta di difesa. Il riconoscimento della forma avviene attraverso

l’interazione tra proteine e proteine. Le proteine si riconoscono a causa del gran

numero di legami intermolecolari che possono essere stabiliti tra la proteina bersaglio

e una proteina vegetale contenente il dominio LRR.

TASSONOMIA ed EVOLUZIONE

I virus si evolvono rapidamente e non mantengono regioni conservate. Per questo la

classificazione arriva fino a famiglia o ordine. Sopra l’ordine si considera la

classificazione Baltimore in sette classi sulla base dell’acido nucleico:

A. Virus a DNA doppio filamento.

B. Virus a DNA singolo filamento.

C. Virus a RNA doppio filamento.

D. Virus a RNA singolo filamento +.

E. Virus a RNA singolo filamento -.

F. Virus a RNA a singolo filamento + con intermedio DNA.

G. Virus a DNA doppio filamento con intermedio RNA.

La nomenclatura non segue Genere specie ma usa il nome dell’ospite, del sintomo

principale seguito da virus o viroide. Il nome viene abbreviato con le iniziali. Per altri livelli

tassonomici sono invece parole latine con desinenza: -virales per l’ordine, -viridae per la

famiglia e –virus per il genere. Alla stessa famiglia appartengono virus con virione simile,

allo stesso genere appartengono virus con genoma similmente organizzato, alla stessa specie

appartengono virus con omologia nella sequenza e che occupano una definita nicchia

ecologica.

Evoluzione nei virus:

La popolazione virale è eterogenea a causa di mutazioni, superinfezioni e ricombinazioni.

- Mutazione: enzimi polimerasici introducono errori durante la replicazione. In

particolare, le RNA polimerasi RNA dipendenti usate dai virus a RNA non hanno

attività di proof reading e quindi commettono molti errori. Siccome i virus hanno

genoma ridotto e pochissimi geni, la probabilità che la mutazione abbia influenza sul

rapporto con l’ospite è elevata.

- Superinfezione: le popolazioni virali presenti in un solo individuo ospite possono

provenire da diverse infezioni e quindi possono intervenire ricombinazioni che

producono nuove sequenze.

- Ricombinazione: rottura e riunione = ricombinazione classica (virus a DNA), scelta

di copia (virus a RNA nella quale la RpRd salta da un segmento ad un altro

producendo un RNA proveniente da più origini) e riassortimento (virus a RNA

segmentato).

Le nuove varianti emergono velocemente a causa della velocità di produzione dei virus. Nelle

piccole popolazioni non ricombinanti di patogeni obbligati esiste il fenomeno del muller

ratchet, in quanto le mutazioni casuali sono deleterie e quindi diminuiscono la fitness della

popolazione.

È comunque possibile definire relazioni di parentela tra i virus grazie al fatto che le mutazioni

letali impediscono alla proteina codificata dal gene di svolgere la sua funzione biologica. Nei

geni esistono regioni nelle quali è possibile un'ampia variazione e delle regioni in cui le

variazioni sono meno frequenti = conservate. Grazie a questo è possibile ricostruire la storia

evolutiva recente, l’origine del virus e i rapporti evolutivi. Le sequenze più simili dovrebbero

avere un progenitore più prossimo di sequenze con maggiore diversità (filogenesi). I virus si

definiscono re-emergenti in quanto possono spostarsi grazie a funghi e batteri.

La filogenesi è utile anche per individuare l’emergenza di gruppi più virulenti (es.: GPGV).

La teoria dell’orologio molecolare prevede che ci sia un tasso di cambiamento costante

nella sequenza nel tempo evolutivo. Diverse proteine però possono evolvere a velocità

diverse e alcune sequenze non codificanti possono essere altamente conservate (in particolare

le sequenze di riconoscimento essenziali per la replicazione del genoma).

Sulla variazione dei virus possono agire le pressioni selettive. I ceppi si differenziano con

mutazioni e piccole inserzioni o delezioni che possono essere selezionate per migliorare

l’adattamento o per mantenere una certa diversità (quasi-specie), questo processo di selezione

si chiama microevoluzione. Cambiamenti più grandi causati dalla ricombinazione e

acquisizione di nuovi geni è chiamata macroevoluzione e genera nuovi generi o famiglie.

Alcuni generi di virus si evolvono rapidamente altri più lentamente, quelli più lentamente

diciamo che sono in una fase stabile in cui sono adatti all’ambiente. Lo stadio di equilibrio

esiste quando il virus non danneggia la specie ospite al punto da comprometterne la

sopravvivenza.

Epidemiologia e modelli:

I modelli matematici forniscono una struttura per descrivere e prevedere l’interazione tra

ospite e patogeno. La caratteristica fondamentale del modello SIR generico è che la

popolazione di individui è suddivisa in suscettibili, infetti e infettivi, guariti o rimossi.

Ci sono anche delle assunzioni:

- Popolazione costante (nascite = morti).

- Tutti quelli di una classe sono nella stessa condizione e non ci sono dinamiche interne

nello stato di un individuo infetto e nella sua capacità di trasmettere infezione.

- Ogni individuo è indipendente e con lo stesso numero di contatti.

Ci sono anche modelli più complessi (SIER) che tengono conto degli esposti ma non

necessariamente contagiati.

Il modello SIR ha una formula che permette di calcolare dal numero di infetti, il rapporto

riproduttivo di base (numero atteso di infezioni secondarie da un singolo caso in una

popolazione completamente suscettibile).

Per la diffusione del virus nelle piante può essere utilizzata una variazione del SIR in cui c’è

una modifica all’equazione 2.2, viene inserito il valore k che stima la trasmissione via vettore

(transmission rate = quante nuove piante infette al giorno per ogni pianta precedentemente

infettata) e al posto di mu+gamma c’è un valore omega che considera l’estirpazione e

l’impianto. Bisogna anche tenere conto della dimensione della popolazione virale, perché

nella pianta la distribuzione è irregolare e può muoversi più o meno velocemente,

influenzando la probabilità di acquisizione da parte di un vettore. L’equazione contenente la

dimensione della popolazione virale diventa:

Possono essere fatte anche altre modifiche tenendo conto della capacità massima dell’ospite

(popolazione non può salire oltre un certo limite), presenza di altri virus, silenziamento...

La valutazione dell’andamento dell’epidemia serve per determinare il re-impianto o l’estirpo,

la lotta obbligatoria contro il vettore, le misure di quarantena...

Satelliti e viroidi:

I satelliti sono piccole molecole di RNA, contenute dal capside, che dipendono da un altro

virus per la replicazione. Molti sono associati a virus vegetali. I satelliti sono distinti in:

- Virus satelliti che codificano le proprie proteine dal capside.

- RNA satellite che utilizzano le proteine del virus helper per la costruzione del capside.

I genomi hanno 500-2000 nucleotidi di ssRNA e non hanno somiglianza con i virus helper.

Causano sintomi di malattie distinte e la replica dei satelliti interferisce con la replicazione

del virus helper. Es.: RNA satellite del virus del nanismo giallo dell’orzo (helper: luteovirus).

I satelliti possono replicarsi nel citoplasma utilizzando una RNA polimerasi RNA dipendente

del virus helper.

I viroidi sono molecole di RNA piccole (200-400 nt) con struttura secondaria a bastoncello,

senza capside e costituiti solo da una molecola di acido nucleico, replicata con meccanismo

RCR. È formato da un RNA circolare disposto in modo da creare due estremità di catena

singola e una parte centrale a doppio filamento.

Es.: viroide del tubero fusiforme della patata (PSTVd, Vd = viroide). I viroidi non codificano

alcuna proteina e sono replicati dalla RNA polimerasi DNA dipendente della cellula ospite

con meccanismo rolling-circle-replication (RCR), nel nucleolo, seguito da scissione

autocatalitica e autole