Appunti di Microbiologia/Virologia

 VITE MACROMETRICA E VITE MICROMETRICA

Manopole di regolazione per la messa a fuoco dell’immagine. Permettono di fare spostamenti più

(macrometrica) o meno (micrometrica) sensibili del tavolino porta preparati, avvicinandolo o

allontanandolo dall’obiettivo, fino a quando non si rende visibile il preparato.

 PROPRIETA’: INGRANDIMENTO, RISOLUZIONE, CONTRASTO

 INGRANDIMENTO e RISOLUZIONE

Per conoscere il potere d’ingrandimento del microscopio si moltiplica il potere d’ingrandimento dell’oculare

per quello dell’obbiettivo.

La risoluzione è la capacità di vedere due punti molto vicini come distanti e separati.

L’occhio umano può essere considerato un microscopio

semplice. L’immagine di un oggetto (Ob) formata sulla retina, è

più piccola quando questo è lontano dall’occhio (Im1) rispetto a

quando lo stesso oggetto è più vicino (Im2).

Tuttavia l’occhio umano non può risolvere due punti come entità

separate se essi sono distanziati meno di 125 µm.

Quindi, indipendentemente dalla possibilità di ingrandirli, in

queste condizioni i due punti appariranno come uno solo.

L’ingrandimento quindi deve essere accompagnato dalla risoluzione.

Il microscopio ottico utilizza un sistema di lenti convergenti dell’obiettivo per indirizzare e focalizzare i raggi

luminosi in modo da produrre un’immagine ingrandita di oggetti molto piccoli.

L’immagine dell’oggetto viene poi ulteriormente ingrandita dalle lenti dell’oculare.

Ingrandimento totale microscopio = ingrandimento obiettivo x ingrandimento oculare

Il microscopio ottico composto permette di ottenere un ingrandimento utile massimo di circa 1000 volte.

La massima risoluzione di un microscopio ottico è 0,2 μm.

 CONTRASTO

Può essere definito come la differenza di intensità di illuminazione fra l’immagine di un oggetto e quella dei

suoi dintorni. Nel caso di cellule in soluzione l’immagine degli oggetti è poco visibile ed aumentare il potere

risolutivo del microscopio è inutile se il contrasto è insufficiente, e quindi l’immagine finale ottenuta è

indistinguibile dallo sfondo.

In un’osservazione al microscopio, una cellula microbica è sospesa in acqua in uno strato sottile tra vetrino

portaoggetti e coprioggetti. I vetrini trasmettono meno luce rispetto l’acqua.

Di conseguenza Per aumentare il fattore dovuto all’assorbimento di luce, ed avere quindi un’immagine più

contrastata, si utilizzano procedimenti di colorazione o in alternativa microscopi a contrasto di fase.

56  PREPARATI (per l’esame al microscopio ottico)

 sospensione degli organismi in un liquido. Si possono guardare microrganismi cresciuti in una

provetta.

 strati (film) o strisci del campione essiccati, fissati e colorati.

 PREPARAZIONE DEI VETRINI

 preparato a fresco: la coltura, ovvero il preparato, è vitale,

quindi si osservano dei processi biologici. Tale tecnica è

necessaria quindi per osservare:

- la morfologia dei batteri;

- mobilità batterica;

- variazioni citologiche che avvengono durante la divisione

cellulare;

- alcune inclusi nella cellula (ad es. sostanze grasse).

La goccia è di circa 10 microlitri; si mette poi un posavetrino.

 preparati a secco: prevede l’utilizzo di strisci

fissati (col calore) e poi colorati, quindi si

osservano cellule morte.

Le cellule diventano visibili più chiaramente quindi se

vengono colorate.

La colorazione semplice è la colorazione mediante

l’applicazione di una singola soluzione di colorante a uno striscio batterico fissato.

 COLORAZIONE DEI PREPARATI

Appropriate soluzioni coloranti quindi permettono di visualizzare le differenze tra cellule di diverse specie o

all’interno della stessa. La colorazione può essere differenziale o selettiva.

La colorazione differenziale richiede l’uso di diversi coloranti, ed di una procedura più complessa.

Colorazioni differenziali sono:

- colorazione di Gram (Gram+ e Gram-);

- colorazione di Giemsa (parassiti endocellulari);

- colorazione con il Verde di Malachite per evidenziare le spore (colorazioni strutturali).

E’ anche possibile effettuare delle colorazioni strutturali, cioè colorare strutture cellulari specifiche:

- capsula batterica: con una goccia di inchiostro di china la capsula appare come un

alone trasparente intorno alla cellula;

- flagelli: non si vedono al microscopio a meno di depositare sostanze colorate che ne aumentano lo

spessore. 57

 MICROSCOPIO OTTICO IN CAMPO CHIARO E IN CAMPO SCURO

 in campo chiaro: la visualizzazione del campione avviene grazie alle

differenze di contrasto tra le cellule e il mezzo e alla capacità delle cellule di

assorbire e disperdere la luce

 in campo scuro: è un microscopio ottico in cui il sistema di illuminazione è

stato modificato in modo che raggiunga il preparato solo lateralmente.

L’unica luce che raggiunge la lente è quella dispersa dal campione: esso

appare quindi chiaro in campo scuro.

La visualizzazione in campo scuro è permessa dal contrasto

di fase. Si tratta di una modificazione inserita nel

condensatore: si basa sul principio che le cellule hanno un

indice di rifrazione diverso da quello del mezzo e quindi

deviano la luce ritardandola. Nel contrasto di fase quindi un

anello (anello di fase) inserito nel condensatore del microscopio amplifica questo effetto e porta alla

formazione di un’immagine scura in campo chiaro.

Per migliorare il potere risolutivo dovrei aumentare l’apertura del diaframma, ma questo introdurrebbe

maggiori aberrazioni (raggi meno parassiali)

Si può vedere che i microorganismi si dispongono su più

piani.

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 CAMERA DI CONTA: CAMERA DI THOMA

Le camere di conta permettono di contare i

microorganismi.

La camera di conta è costituita da una zona incavata

delimitata da un vetrino a facce perfettamente piane e

parallele. Questa zona può avere diverse profondità:

 0,1 mm=camera di Thoma

 0,02 mm= camera di Petroff-Hauser

La camera di THoma utilizza un vetrino reticolato che

presenta dei settaggi: ci sono linee verticali che

incrociano linee orizzontali; questi incroci formano 16

quadratini; i 16 quadratini formano 1 quadrante.

Questi quadranti vengono utilizzati per determinare il

numero totale dei microorganismi sia vivi che morti. 2

Ogni quadrato ha un lato di 1 mm, ed ogni quadratino ha una superficie di 0,0025 mm

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PREPARAZIONE:

Pulire con alcol e carta morbida il vetrino ed il copriivetrino e non passare su fiamma! Posizionare la goccia

di campione (o diluizione) sul reticolo ed appoggiare il coprivetrino in modo obliquo per non far formare

bolle che impedirebbero la conta.

CONTA E CALCOLO DEI MICRORGANISMI PRESENTI:

Si contano i microrganismi nella diagonale, di quattro quadratini in quattro…

ESEMPIO DI CALCOLO:

1° quadrante:34

2° quadrante: 32

3° quadrante: 38

4° quadrante: 35

totale: 139 Questa è una stima del numero di microorganismi presenti in un

campione.

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 MICROSCOPIO OTTICO A FLUORESCENZA

Un microscopio a fluorescenza, è un microscopio ottico utilizzato per

studiare campioni organici o inorganici, sfruttando i fenomeni della

fluorescenza e della fosforescenza indotti nel campione.

E’ costituito da:

o sorgente di luce UV: è lampada a vapori di mercurio che

emette nell’ UV-visibile;

o condensatore con lenti in quarzo: permettono il passaggio

dei raggi UV;

o obiettivo con lenti di vetro: trattengono le radiazioni UV

permettendo il passaggio della radiazione visibile

formatasi per fluorescenza;

 fluorescenza primaria: prodotta naturalmente dal preparato;

 fluorescenza secondaria: indotta dal trattamento con sostanze fluorescenti. 59

 MECCANISMO

Le lunghezze d’onda d’ eccitazione (λ1; λ2; λ3) vengono

selezionate dal filtro di eccitazione (EX) e dirette attraverso il

ripartitore dicroico (DB) al campione (sample).

Il fluoroforo (sostanza in grado di produrre fluorescenza dopo

aver assorbito fotoni di una certa lunghezza d’onda) aggiunto al

campione assorbe λ2 ed emette a λ superiore (λ4).

λ4 attraversa il ripartitore dicroico e attraversa il filtro di

emissione (EM) che blocca gli altri componenti di emissione (λ5) e

raggiunge l’osservatore.

Un esempio di fluorescenza semplice: DAPI viene eccitato nell’UV vicino a 365 nm ed

emette nel campo spettrale del blu-violetto.

La fluoresceina è un indicatore. A temperatura ambiente si presenta come un solido rosso-bruno inodore,

che emette un’intensa fluorescenza nella gamma 520-530 nm quando viene eccitata da raggi ultravioletti a

254 nm e nella gamma del blu

MICROSCOPIA E OSSERVAZIONE TRIDIMENSIONALE

 microscopia a contrasto di fase interferenziale (DIC) o Nomarski: utilizza luce polarizzata e

visualizza preparati chiari in campo chiaro; evidenzia strutture cellulari interne);

 microscopia confocale a scansione laser (CSLM): associa un laser come fonte luminosa alla

microscopia ottica. Permette di analizzare ogni piano di un preparato, quindi permette di osservano

i biofilm microbici.

Esempio di biofilm: I batteri nel biofilm sono Pseudomonas putida OUS82 (marcatura

GFP) e Pseudomonas sp. B13 (marcatura DsRED).

Si distinguono chiaramente le micro-colonie di ciascuna specie (rosso o verde).

Tuttavia, in ogni micro-colonia, vediamo anche alcune altre specie di batteri.

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MICROSCOPIO ELETTRONICO

Il microscopio elettronico è usato nei casi in cui la risoluzione di un microscopio ottico è troppo bassa per

distinguere i particolari che si vogliono osservare.

 MECCANISMO

- sfruttano elettroni che hanno una radiazione di bassissima λ;

- la lunghezza d’onda degli elettroni va da 0.1 a 0.005 Å (1 Angstrom = 10-10 metri) in modo da risultare

alcune decine di migliaia di volte più piccola della luce visibile;

- i normali dispositivi ottici non deviano gli elettroni, si ricorre quindi a lenti elettro-magnetiche che, agendo

sulla carica elettrica degli elettroni, ne provocano la deviazione;

- il microscopio elettronico lavora nel vuoto ultra spinto assicurato da un sistema di pompe;

- pur non raggiungendo i limiti teorici, il microscop