Appunti di Biologia

LA REPLICAZIONE DEL DNA

La replicazione del DNA consente la trasmissione genetica dalla cellula madre alle cellule figlie.

Il DNA viene replicato con precisione durante la divisione cellulare, assicurando una trasmissione fedele delle informazioni

genetiche.

Fra tutte le molecole, gli acidi nucleici sono gli unici in grado di avviare la propria replicazione a partire da semplici monomeri.

-I legami a H fra le basi si rompono

-ciascun filamento serve da stampo per la definizione dell’ordine dei nucleotidi del nuovo filamento, che si allineano stando alle

regole «dell’appaiamento complementare»

-ciascuna molecola di DNA a doppio filamento si trasforma in due ciascuna delle quali è una copia della molecola madre

� Modello conservativo

dopo avere funzionato da stampo, i due filamenti parentali si riassociano fra loro per formare la molecola originale.

Le due molecole di DNA sono costituite da due filamenti nuovi e da due parentali

� Modello dispersivo

Le due molecole di DNA sono costituite sia da parte di filamenti nuovi che da parti di filamenti parentali

� Modello semiconservativo

-questo modello si definisce semiconservativo (la copia contiene un filamento «madre» e un filamento «di nuova

sintesi»

-questo modello è stato verificato da Matthew Meselson e Franklin Stahl , supportando il modello postulato da

Watson e Crick

-fecero crescere due colture di E.coli con due terreni diversi, uno contenente 14N e uno contenente 15N.

-Il DNA estratto dai batteri cresciuti in terreno con 15N origina una banda pesante, l’altro una banda leggera

1)alla prima generazione l’estrazione del DNA mostra una banda intermedia

2)alla seconda generazione banda intermedia + banda leggera>> scomparsa la banda pesante

Questo è possibile perché ogni molecola di DNA ad ogni generazione contiene una molecola stampo di DNA su cui si

forma il DNA complementare>> meccanismo semiconservativo

In questo modo ogni nuova molecola di DNA formata ha un filamento «conservato» dal DNA parentale e da uno

nuovo

-batteri: 1 unico cromosoma, 4.6 milioni di coppie di nucleotidi

-uomo: 46 cromosomi, una lunga molecola a doppio filamento in ciascun cromosoma, 6 miliardi di coppie di nucleotidi

-La replicazione è un meccanismo straordinariamente preciso (circa 1 errore ogni 10 miliardi di nucleotidi) e straordinariamente

veloce (qualche ora nelle cellule umane, minuti nelle cellule batteriche)

-3 fasi che coinvolgono più di una dozzina di enzimi e altre proteine:

1) srotolamento e apertura dei filamenti

L’uso del DNA come stampo:

- comporta il riconoscimento di ciascun nucleotide nel filamento stampo di DNA da parte di un nucleotide libero

- richiede la separazione dei 2 filamenti dell’elica di DNA che è operata dall’enzima elicasi

2) Appaiamento delle basi complementari e polimerizzazione

Il primo enzima che polimerizza i nucleotidi è la DNA polimerasi, la quale necessita di DNA stampo a singolo filamento

all’estremità 3’-OH di una catena nucleotidica. L’attacco a cui si lega la DNA polimerasi richiede inoltre un filamento

primer appaiato al filamento stampo.

La replicazione inizia in punti specifici definiti ORIGINE di REPLICAZIONE in corrispondenza dei quali inizia l’apertura delle

due eliche (forcella di replicazione) La DNA polimerasi opera a livello di una zona attiva di replicazione chiamata forcella di

replicazione.

2) Necessitano di un filamento primer (innesco ) per iniziare la sintesi , aggiungendo nucleotidi a un 3’OH

3) Per iniziare la sintesi sono necessari primer a RNA (non DNA) di circa 5-10 nucleotidi sintetizzati dall’enzima RNA

primasi usando come stampo il DNA parentale

3) Unione dei due nuovi filamenti

sono assistiti da complessi enzimatici definiti DNA polimerasi

MECCANISMI DI REPLICAZIONE DEL DNA La replicazione inizia in punti specifici definiti

ORIGINE di REPLICAZIONE in corrispondenza

dei quali inizia l’apertura delle due eliche

(forcella di replicazione) La DNA polimerasi

opera a livello di una zona attiva di

replicazione chiamata forcella di replicazione.

Tutte le DNA polimerasi note sintetizzano il

DNA in direzione 5’-3’, i nucleotidi vengono

aggiunti sempre all’estremità 3’-OH del

filamento che si sta sintetizzando, come copia

del filamento stampo.

La sintesi del DNA richiede che la doppia elica

venga aperta davanti alla forcella di replicazione.

L’apertura della doppia elica è resa possibile da:

1. DNA elicasi: sono proteine che utilizzando ATP aprono la doppia elica di DNA e si legano al singolo filamento;

2. proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB): si legano a filamenti esposti di DNA a singolo filamento senza coprire le

basi. Queste proteine aiutano le elicasi stabilizzando il filamento di DNA singolo e raddrizzandolo.

1) DNA polimerasi DNA-dipendenti sintetizzano polideossinucleotidi in direzione 5’-3’,

2) Necessitano di un filamento primer (innesco ) per iniziare la sintesi , aggiungendo nucleotidi a un 3’OH

3) Per iniziare la sintesi sono necessari primer a RNA (non DNA) di circa 5-10 nucleotidi sintetizzati dall’enzima RNA primasi

usando come stampo il DNA parentale

DNA polimerasi DNA-dipendenti sintetizzano polideossinucleotidi in direzione 5’-3’, (11 Polimerasi negli eucarioti)

- l’elicasi si muove in una sola dimensione, srotolando progressivamente

I due filamenti antiparalleli non possono essere duplicati nello stesso modo:

-il filamento guida può essere sintetizzato nella stessa direzione dell’elicasi (5’-3’)

-l’altro filamento (detto filamento in ritardo) non può essere sintetizzato in maniera continua, perché non possiede un –OH 3’ al

punto di biforcazione

Ciascun nucleotide aggiunto è formato da uno zucchero+base azotata + 3 gruppi fosfato

ATP è formato da deossiribosio mentre l’ATP utilizzato nel metabolismo energetico è formato da ribosio come zucchero

-Affinché l’altro filamento si allunghi nella direzione OBBLIGATORIA 5’-3’, la polimerasi si dovrebbe allontanare dalla forca (per

questo il secondo filamento viene detto filamento ritardato

-Il filamento in ritardo viene sintetizzato in modo discontinuo (non come il filam. guida), sotto forma di brevi segmenti detti

frammenti di OKAZAKY (1000-2000 nucleotidi in E.coli e 100-200 nucleotidi in eucarioti)

-mentre per il filamento guida è richiesto un solo primer di innesco, ciascun frammento di Okazaky richiede un primer

La sintesi di ciascun frammento di Okazaki termina quando la DNA polimerasi incontra l’RNA primer attaccato all’estremità 5’ del

frammento precedente.

Per originare una catena continua anche sul filamento ritardato, l’RNA primer alla fine viene rimosso e sostituito da DNA e un

enzima, la DNA ligasi, unisce l’estremità 3’ del nuovo frammento di DNA all’estremità 5’ di quello precedente.

Nel caso del DNA lineare, come negli eucarioti , il filamento ritardato non può essere replicato completamente, perché l’ultimo

innesco, quando viene rimosso non può più essere sostituito (ricordo che la polimerasi funziona solo in direzione 5’-3’)

La telomerasi è un enzima che, utilizzando come stampo un RNA che fa parte del complesso enzimatico della telomerasi, aggiunge

la sequenza telomerica all’estremità 3’ del filamento stampo

Proteine coinvolte nella replicazione del DNA:

➢ Elicasi

➢ SSB (proteine che legano il DNA e lo mantengono aperto)

➢ RNA primasi

➢ DNA polimerasi III e DNA polimerasi II

➢ DNA ligasi

Meccanismi di replicazione del DNA-RIASSUMENDO:

➢ ➢

Le eliche del DNA devono essere mantenute separate durante il processo (ruolo delle SSB) La sintesi avviene sempre in direz

5’-3’

➢ La sintesi necessita di un innesco, primer RNA

➢ La replicazione avviene in modo continuo su un filamento e discontinuo sull’altro

➢ La sintesi è bidirezionale

➢ La sequenza deve essere mantenuta costante durante le generazioni>>>modello accurato e preciso

➢ Mutazioni nella sequenza possono avere conseguenze. Tuttavia, il meccanismo è ad alta fedeltà ma non è perfetto e possono

esserci errori di replicazione. Ci possono essere anche danni dovuti a fattori ambientali (raggi UV, radiazioni ionizzanti, composti

mutageni)

➢ Le cellule normali hanno meccanismi di rivelazione dell’errore (per esempio incorporazione di nucleotidi errati) o di danni

(causati da agenti ionizzanti, UV) e meccanismi di riparazione

➢ Errori di appaiamento sono 1 su 1015 nucleotidi

➢ La frequenza degli errori sull’intera molecola di DNA si riduce a 1 su 1010 (10 miliardi)

➢ Questo perché durante la replicazione le DNA polimerasi verificano la correttezza dell’appaiamento tra i nucleotidi e lo stampo

nel momento stesso in cui si uniscono al filamento da estendere.

➢ Nel caso di errori di un nucleotide, la polimerasi rimuove il nucleotide appaiato scorrettamente e prosegue la sintesi (come la

cancellazione di un tasto battuto male al computer)

➢ Alcuni errori possono sfuggire alla polimerasi>>in questo caso entrano in gioco altri sistemi di riparazione degli errori, che

rimuovono e sostituiscono i nucleotidi corretti

➢ Nell’uomo identificati circa 170 enzimi riparatori

➢ Difetti nei meccanismi di riparazione cellulare possono creare tumori e patologie genetiche

➢ Molti sistemi utilizzano nucleasi (enzimi che tagliano il filamento danneggiato, che viene rimosso e sostituito dalle polimerasi con

nucleotidi appaiati correttamente sfruttando lo stampo. Esempio nelle cellule della cute>>correzione delle anomalie determinate

da UV

CROMOSOMI E GENI

I cromosomi portano i geni, le unità funzionali dell’eredità. Un gene è definito come un

segmento di DNA che contiene le istruzioni per produrre una particolare proteina (o una

serie di proteine strettamente correlate) o una particolare molecola di RNA.

Solo una parte del DNA che costituisce un gene è necessario per codificare una proteina. Il

DNA rimanente, la maggior parte, consiste in lunghi tratti di DNA non codificante che

interrompe i brevi segmenti di DNA codificante. Le sequenze codificanti sono chiamate esoni; le sequenze intercalate sono dette

introni. Oltre a introni ed esoni, ogni gene è associato a sequenze regolatrici di DNA, responsabili dell’espressione del gene, al

momento e al livello appropriati.

CROMATINA

Nel nucleo possono essere distinti 2 tipi di cromatina:

- eterocromatina: è una forma altamente condensata di cromatina particolarmente resistente all’espressione genica

- eucromatina: forma meno condensata di cromatina, a livello della quale i geni possono essere espressi.

ORGANIZZAZIONE DEL DNA: il nucleosoma

Le proteine che si legano al DNA per for