Appunti dettagliati di Metodi molecolari

T

fluorescenza di un campione interseca e supera la

soglia. È inversamente proporzionale alla quantità di

templato iniziale: quantità maggiori di templato

daranno origine a C più bassi. Se il campione A ha Ct

T

= 20 e il campione B ha Ct = 25, il campione A rappresenta una quantità di stampo maggiore rispetto al

campione B.

Durante la fase esponenziale, la quantità di prodotto in teoria raddoppia ad ogni ciclo, qualora l’efficienza della

ΔCt

reazione sia del 100%. In questo caso, l’equazione 2 misura la differenza tra due campioni in funzione del

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materiale di partenza con (ΔC =1 corrisponde al doppio del materiale di partenza). Nel campione A ci sono 2 =32

q 32

volte più stampo che nel campione B.

In realtà, l’efficienza non è del 100%, e di solito si confronta l’amplificazione con una curva standard di concentrazioni

di stampo note, per essere sicuri di effettuare una quantificazione accurata.

● Normalized reporter (R ): un valore normalizzato della fluorescenza, dato dal rapporto dell’intensità di

n

fluorescenza del fluorocromo e l’intensità di fluorescenza del passive reference dye (ROX™).

ΔR = entità del segnale generato, nelle condizioni di reazione specificate. ΔR =R – baseline.

n n n

Le principali differenze tra qPCR e PCR convenzionale sono:

● Possibilità di monitorare la reazione in corso;

● Il fatto di essere quantitativa;

● La qPCR ha un elevato dynamic detection range, il che permette un ampio range di applicazioni;

● Una maggiore sensibilità, in quanto permette di identificare differenze anche dell’ordine del 2X; quindi

richiede limitate quantità di campione di partenza.

● L’amplificazione e la detection avvengono in un unico tubo, perciò si elimina il post-processamento (calcolo

della Tm), si aumenta il throughput (no gel) e si riduce il rischio di “carry over contaminations”.

Le componenti della reazione di qPCR sono le seguenti:

1. Templato: gDNA, cDNA…

2. DNA polimerasi hot-start

3. dNTPs

4. MgCl

2

5. Primers

6. Passive reference dye (ROX™): molecola fluorescente che si aggiunge alla reazione per ridurre la

variabilità intrinseca del sistema, in quanto permette di correggere in maniera automatica il valore di

fluorescenza emesso dal reporter attraverso il parametro R .

n

7. Reporter fluorescente: si possono distinguere due categorie di molecole fluorescenti:

a. DNA-binding dyes: molecole che diventano fluorescenti quando legano DNA a doppio filamento,

come SYBR green.

b. Sonde e primer di PCR fluorescenti, di diverso tipo: molecular beacons, scorpions PCR primers,

TaqMan (hydrolysis probes), dual hybridization probes, eclipse probes…

SYBR green

Il metodo più semplice per ottenere la quantificazione in tempo reale è quello di aggiungere alla miscela un

colorante come SYBR green, che diventa fluorescente quando si lega a dsDNA.

SYBR green è una molecola fluorescente non specifica, che si lega al solco minore del DNA a doppio filamento.

Quando risulta legato al DNA, si eccita ed emette una fluorescenza molto più intensa rispetto a quella emessa in

forma non legata. Si lega soltanto al dsDNA, per cui solo durante la fase di estensione di ciascun ciclo; all’inizio, lo

stampo è a singolo filamento, per cui non vi è alcun segnale (baseline orizzontale). Con il procedere

dell’amplificazione, si forma un prodotto a doppio filamento, e ad un certo punto viene prodotta una quantità di

amplificato sufficiente affinché la fluorescenza sia misurabile dallo strumento. Dopo un certo numero di cicli, il

livello della fluorescenza aumenta, ed estrapolando a zero la curva risultante si può determinare il numero di cicli

necessari per la formazione di una quantità misurabile di prodotto (C ).

T

Essendo una molecola non specifica, è possibile utilizzare gli stessi primer che si utilizzerebbero in una reazione

di PCR di routine. Tuttavia, questa strategia può dare origine a degli artefatti: non vi è alcuna garanzia, a parte la

specificità dei primer, che la fluorescenza rilevata sia dovuta alla formazione del prodotto specifico; se viene

amplificato un prodotto sbagliato non è possibile distinguerlo da quello corretto.

È possibile superare questo problema programmando il termociclatore in modo tale da generare una curva di

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melting del prodotto al termine dell’amplificazione. Dato che la T di un frammento di DNA dipende

m

esclusivamente dalla sua lunghezza e dalla sua sequenza, l’analisi del punto di melting può essere usata per

stabilire il numero di prodotti di amplificazione di una reazione. Se da questa analisi si ottiene una sola curva,

significa che durante la PCR si è formato un solo prodotto, presumibilmente quello specifico. Se invece compaiono

più curve, significa che si è verificata dell’amplificazione aspecifica, riducendo la natura quantitativa della PCR. In

tali circostanze, è necessario ottimizzare ulteriormente le condizioni di PCR o utilizzare nuovi primer.

TaqMan

La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide

che, come i primer della PCR, viene disegnato

per essere complementare alla sequenza

bersaglio da amplificare. La sonda è disegnata

in modo tale da ibridarsi all’interno del

frammento amplificato nella reazione (NB: non sostituisce i primer). Questa sonda è marcata in modo tale da

emettere fluorescenza soltanto in conseguenza della reazione di PCR:

- 5’-Reporter (R): al 5’ della sonda, fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza.

- 3’-Quencher (Q): fluorocromo a bassa energia che maschera la fluorescenza del reporter.

Se Q e R si trovano contemporaneamente legati alla sonda, Q spegne l’effetto di R poiché assorbe i fotoni di

quest’ultimo. FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) = fenomeno di trasferimento energetico tra

fluorofori; quando un fluorocromo ad alta energia è in prossimità di uno a bassa energia, vi è trasferimento di

elettroni dal primo al secondo.

NB: Le condizioni essenziali affinché avvenga il FRET sono:

a. l’energia persa per il ritorno allo stato basale della molecola donatrice deve essere uguale all’energia

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richiesta per eccitare l’accettore. Lo spettro di assorbimento delle due molecole deve quindi sovrapporsi.

b. Donatore ed accettore devono essere molto vicini, tipicamente 10-100 Å. È un trasferimento di energia

distanza-dipendente tra stati elettronici eccitati di due fluorocromi. La ρ (ro) è la distanza alla quale il

trasferimento di energia è efficiente al 50%, e quindi alla quale il 50% delle molecole donatrici attivate

sono deattivate dal FRET.

Quindi, all’inizio della reazione, quando i due fluorocromi sono vicini tra loro, non vi è emissione di fluorescenza.

Con il procedere della reazione, l’oligonucleotide e i primer si legano progressivamente al numero in aumento dei

filamenti neosintetizzati. Quando il filamento complementare alla sonda si duplica, l’attività exo 5’-3’ intrinseca

della polimerasi taglia via prima il gruppo 5’-R dalla sonda; in questo modo, il fluoroforo viene allontanato dal

quencer, permettendogli di emettere la fluorescenza. Quindi, l’intensità della fluorescenza emessa rappresenta

una misura direttamente proporzionale alla quantità di prodotto formato.

Poiché la sequenza oligonucleotidica dela sonda è complementare ad una regione interna dell’amplificato,

indipendente dai primer, il sistema offre una grande specificità.

Molecular beacons

Anche un altro metodo, chiamato “molecular beacon”, sfrutta una

sonda contenente un fluoroforo ed un quencer. In questo caso però

la sonda non è lineare come per il metodo TaqMan, bensì con

estremità complementari tra loro, che permettono la formazione di

una struttura a forcina quando non è ibridata alla sequenza target. In

questa conformazione, il loop contiene una sequenza

complementare ad una regione interna del target, ed il fluoroforo ed

il quencher sono tra loro vicini, perciò il reporter non emette

fluorescenza.

Con l’appaiamento della sonda alla sequenza di DNA, il molecular

beacon si ibrida in forma lineare: fluoroforo e quencher si

allontanano, e l’emissione fluorescente del reporter, quando eccitato

con luce UV, può essere rilevata. Anche in questo caso la DNA polimerasi rimuove la sonda: il molecular beacon

assume nuovamente la conformazione a forcina ed il reporter torna inattivo.

I valori di fluorescenza durante la reazione sono una misura del numero di molecole amplificate. 35

Scorpions

Le sonde scorpions sono costituite da una sequenza di DNA a singolo filamento in una confermazione a forcina,

dotata di un 5’-R ed un 3’-Q. il quencher risulta legato direttamente all’estremità 5’ del primer della reazione di

PCR, grazie alla mediazione di un blocker.

All’inizio della reazione, la polimerasi estende il primer e sintetizza il filamento complementare della sequenza

target. Durante il ciclo successivo, la forcina si apre, e la regione interna della sonda si ibrida intramolecolarmente

alla sequenza appena sintetizzata, liberando il reporter. In questa situazione, si verifica un’emissione di

fluorescenza che può essere rilevata, e che risulta direttamente proporzionale al numero di molecole di DNA

prodotte.

Pro e contro dell’uso di SYBR green:

- PRO: metodica semplice, versatile e a basso costo.

- CONTRO: aspecifica, in quanto la molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, inclusi i

dimeri di primer; è necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici;

richiede la costruzione di una retta standard e l’analisi della curva di melting.

Pro e contro dell’utilizzo di sonde:

- PRO: metodica semplice, elevata specificità, quantificazione attraverso ΔΔCt e maggiore facilità di

multiplexing.

- CONTRO: molto costoso e non versatile.

Quantificazione

Esistono due strategie di quantificazione dei prodotti della qPCR:

1. Quantificazione assoluta: si esegue attraverso l’absolute standard curve method, che richiede l’utilizzo di

curve standard di campioni di cui si conosce a priori la quantità.

2. Quantificazione relativa: metodo comparativo, che richiede una referenza, la quale è valutata nella stessa

maniera del target e risulta, quindi, una referenza attiva. Si esegue attraverso due metodi:

a. Relative standard curve method: la quantità relativa del target oggetto di studio si stabilisce in

relazione alla curva costruita sullo standard e alla misura della referenza.

b. Comparative Ct method (&Delta