Appunti dettagliati di Bioinformatica

W = W (C (G), B (G)).

2

Dato che W = 77 e W = 100, il peso risultante viene settato a 77. Nella libreria estesa, questo nuovo

1 2

valore viene aggiunto al precedente in modo da dare un peso totale di 165 per la coppia A (G) e B

(G). L’estensione completa della libreria richiederà un controllo di tutte le triplette rimanenti.

L’allineamento di F con C non viene supportato dal metodo delle triplette, in quanto non porta

nessun guadagno superiore a 88 nella fase di estensione della libreria.

I punteggi ottenuti (invece dei punteggi provenienti dalle matrici standard quali BLOSUM) possono

allora essere usati per allineare qualsiasi delle due sequenze provenienti dal nostro set di dati

usando una programmazione dinamica convenzionale. Otteniamo un set di punteggi che sono

specifici per ciascuna possibile coppia di residui nelle nostre due sequenze. Questo permetterà

l’esecuzione di un allineamento che rappresenterà i particolari residui presenti nelle due sequenze,

ma lo guiderà anche verso una coerenza con tutte le altre sequenze presenti nel set di dati.

Alla fine, l’allineamento viene ottenuto con un metodo progressivo. Questo, però, si basa su

un’informazione più ricca, derivata dagli allineamenti a coppie ma anche dal principio di consistenza,

che tiene conto anche di tutte le altre sequenze del dataset.

Un altro programma, simile a ClustalW, per costruire degli allineamenti multipli progressivi è

Muscle. Questo costruisce una matrice di distanze che compara le coppie così come sono state

allineate. Da questa si ottiene un albero guida attraverso il quale si arriva ad un primo MSA. Con dei

metodi computazionali, ottengo una matrice di distanza con metodo Kimura che mi serve per

costruire un secondo e migliore MSA. A questo punto, costruisco un’ulteriore matrice dal quale

ricavo un terzo albero guida. Da questo, attraverso una riottimizzazione dei sottoalberi, ottengo una

terza versione del MSA. Possono seguire ulteriori ottimizzazioni che mi danno un MSA sempre più

preciso.

Per valutare se le sequenze sono state allineate correttamente, posso eseguire una serie di analisi

qualitative:

A. Sum of pairs: eseguo la somma dei punteggio per tutte gli allineamenti a coppie di sequenza;

B. Reference sum-of-pairs: utilizzo degli allineamenti standard come riferimento;

C. Information content: introduco dei punteggi di entropia (che possono andare da zero a uno)

per le varie colonne nell’allineamento e li sommo tra loro;

D. norMD: introduco dei punteggi per colonna ed eseguo una normalizzazione per il set di

sequenze che vengono allineate (numero, lunghezza, similarità). Un esempio di applicazione

di questo metodo viene rappresentato nell’immagine sottostante.

Sono stati sviluppati anche dei metodi di rilevamento e di correzione degli errori (RASCAL), ma

anche di un loro raffinamento.

Un approccio di valutazione basato sulla concordanza, è quello di combinare gli esiti di numerosi

metodi alternativi in un esito finale (meta-metodi). Il motivo si basa sul ragionamento empirico che

gli errori prodotti da metodologie di predizione indipendenti possono produrre degli errori meno

consistenti. Pertanto, la concordanza tra questi metodi può essere un indice di correttezza. Il

programma M-coffee adotta proprio questa procedura sperimentale.

Il database di allineamenti di riferimento BAliBASE 3.0 offre una collezione di 141 allineamenti

proteici di riferimento, basati anche sulla loro struttura tridimensionale. CI sono 5 set di riferimento

che possono essere usati come utili test in diverse situazioni.

Cap. 3 – Predizione della struttura delle biomolecole

Il DNA e l’RNA sono polimeri lineari di nucleotidi specializzati nel deposito, nella trasmissione e

nell’utilizzo dell’informazione genetica. Gli acidi nucleici possono assumere specifiche forme nello

spazio tridimensionale. In particolare, gli RNA – come le proteine, che sono polimeri di amminoacidi

che svolgono le proprie funzioni proprio in virtù della loro forma nello spazio tridimensionale –

svolgono diverse attività (quali la catalisi) grazie alla loro struttura tridimensionale e alla loro

capacità di appaiamento con gli altri acidi nucleici.

Un nucleotide è formato da:

• Uno zucchero pentoso: che può essere il ribosio (nel caso dell’RNA) o il desossiribosio (nel

caso del DNA);

• Una base azotata: che può essere una C, una T, una U, una A o una G;

• Un gruppo fosfato.

La numerazione degli atomi di carbonio dello zucchero è la base dell’identificazione delle estremità

3’ e 5’ dei filamenti di DNA e di RNA. Nell’RNA, le basi sono legate al ribosio e sono le purine adenina

e guanina e le pirimidine citosina e uracile. Nel DNA, invece, le basi sono legate al desossiribosio ed

è presente l’uracile al poso della timina. Inoltre, i legami idrogeno tra le purine e le pirimidine

tengono insieme i due filamenti di DNA.

Le molecole di RNA possono ripiegarsi grazie all’appaiamento delle basi complementari ed assumere

forme specifiche nello spazio tridimensionale:

• Wooble base pairs (G-U, I-U, I-A, I-C);

• Stem-loop, bulges, tetraloops e pseudoknots.

La principale funzione dell’RNA è di tipo informazionale e risiede nel trasferimento di informazione

dal DNA alle proteine. Esistono, però, anche degli RNA con funzione catalitica e con moltissime altre

funzioni molecolari, che sono i non-coding RNAs.

Gli amminoacidi formano le proteine e sono composti con più gruppi funzionali. Il loro carbonio

alfa (C ) è legato a: un gruppo amminico, un gruppo carbossilico, un atomo di idrogeno e una catena

α

laterale. Nelle molecole dei diversi amminoacidi si ritrovano delle catene laterali diverse in termini

di composizione, di proprietà chimiche e di ingombro sterico. Sono noti circa 500 amminoacidi, dei

quali quelli proteinogenici sono circa 22 e sono di tipo alfa. Di questi, 20 sono quelli codificati dal

codice genetico e 2 sono non canonici (pirrolisina e selenocisteina). Dei 20, 9 sono quelli essenziali

per l’uomo che devono essere assunti con la dieta. I 20 amminoacidi proteinogenici codificati dal

codice genetico vengono divisi convenzionalmente in diverse classi e sono i seguenti:

A. Amminoacidi con residui aventi carica positiva: sono l’arginina, l’istidina e la lisina;

B. Amminoacidi con residui aventi carica negativa: sono l’aspartato e il glutammato;

C. Amminoacidi con residui polari aventi carica neutra: sono la serina, la treonina, l’asparagina

e la glutammina;

D. Amminoacidi con residui idrofobici: sono l’alanina, l’isoleucina, la leucina, la valina la

metionina (questi quelli non aromatici), la fenilalanina, il triptofano e la tirosina (questi ultimi

tre quelli aromatici);

E. Amminoacidi particolari: sono la cisteina, la glicina e la prolina.

Le proteine presentano diversi livelli strutturali:

1. Struttura primaria;

2. Struttura secondaria: motivi ricorrenti sono il foglietto-β, l’α-elica e il β-turn;

3. Struttura terziaria;

4. Struttura quaternaria.

I vari amminoacidi interagiscono tra loro, formando queste strutture, attraverso vari tipi di legami:

• Legame idrogeno: determinano strutture secondarie, ma anche terziarie;

• Legame ionico: interazioni tra cariche opposte, ovvero tra catene laterali cariche;

• Ponti disolfuro: legami covalenti tra catene laterali di cisteina che sono importanti per la

formazione della struttura terziaria;

• Forza di Van der Waals: sono dovute a interazioni tra molecole con distribuzione di carica

asimmetrica (dipoli) e sono forze deboli a breve raggio;

• Interazioni idrofobiche: dovuti all’idrofobia di alcuni amminoacidi, che induce le catene a

ripiegarsi in modo da escludere l’acqua in regioni occupate solo da catene apolari.

Alcuni esempi di fanno capire perché è importante conoscere la struttura di una macromolecola:

A. I residui della triade catalitica nella chimotripsina sono contigui nella sequenza proteica,

determinandone la funzione;

B. Le proprietà catalitiche del ribozima dipendono dalla sua struttura terziaria. Le mutazioni

che ne alterano le interazioni chiave determinano una perdita del ripiegamento e della

funzione.

In molti casi, solo l’analisi della struttura tridimensionale di una macromolecola può aiutarci a

comprendere in quale modo e per quale motivo una determinata sequenza possa svolgere una

funzione precisa. I metodi sperimenali classici per la risoluzione della struttura tridimensionale di

una macromolecola sono di due diverse tipologie:

• Cristallografia a raggi X: dopo aver purificato e cristallizzato una proteina, si esegue una

diffrazione a raggi-x dalla quale si ricava una mappa di densità elettronica;

• Spettroscopia a risonanza magnetica e nucleare (NMR);

Mentre Uniprot/Swissprot contiene 546238 sequenza proteiche, PDB contiene solo 103354

strutture. Questo significa che proteine diverse usano strutture uguali o simili.

L’esperimento di Anfisen del 1973 ha offerto una prova sperimentale che la sequenza primaria di

una proteina ne determina la struttura. Anfisen ha contemporaneamente ridotto (con il β-

mercaptoetanolo) e denaturato (con l’urea) una RNasi. Successivamente, ha rimosso l’urea e ha

riossidato i gruppi sulfidrilici liberi, ottenendo una riattivazione della proteina natura in più del 90%

dei casi. Questo significava che l’informazione contenuta nella sequenza è sufficiente a determinare

il ripiegamento e la funzione della proteina. Inoltre, l’ipotesi termodinamica assume che la struttura

nativa di una proteina corrisponda alla struttura globale termodinamicamente più stabile.

Il paradosso di Levinthal prende in considerazione una proteina costituita da 100 residui. Se

ciascuno di questi può occupare solo tre

3100

posizioni, ci sono conformazioni possibili.

Se il tempo di conversione da una struttura

-13

all’altra è di 10 s, la ricerca esaustiva della

27

conformazione migliore durerebbe 1,6 x 10

anni. Nella realtà, si osserva che le proteine si

ripiegano in tempi di millisecondi (se non di

microsecondi). Questo significa che il folding

deve procedere attraverso una progressiva

stabilizzazione degli intermedi, ognuno dei

quali comporta una riduzione del’energia

libera. Il processo di ripiegamento diventa

irreversibile quando si arriva al cosiddetto

stadio dei globul fusi (molten globules), che

sono stadi intermedi di avvolgimento delle proteine con energia superiore a quella dello stato nativo

ma inferiore a quella dello stato denaturato. Questo significa che l’informazione codificata nella

1

sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa . Lo

stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera