Appunti completi di Genetica e genomica

GENETICA BATTERICA

• Approssimativamente nel mondo fino al 2019 7,7 milioni di morti per infezioni batteriche

- Principalmente Tubercolosi, sepsi, malattie diarroiche, infezioni respiratorie minori

- Altre malattie causate dai microorganismi possono essere: ascessi, batteriemia, carie,

difterite, meningite, salmonellosi, botulismo…

• Microbiota = popolazione microorganismi (funghi, batteri…) che colonizza ambiente o

organismo in un determinato tempo

• Microbioma = totalità del patrimonio genetico espresso dal microbiota

• Metagenomica = andare a sequenziare massivamente (con nuove tecnologie) il DNA dei

microorganismi presenti in un determinato ambiente

• Noi conteniamo moltissimi batteri nel nostro organismo di specie diverse

- Per ogni cell umana presenti circa 10 3 batterica => 3 volte cell batteriche rispetto a umani

- Quindi siamo costituiti più da attesi che da cell

- Circa 37,3 trilioni di cell umane e 100 trilioni di cell batteriche

Genetica batterica

• Analisi genetica su batteri presenta serie di vantaggi rispetto a quella su piante e animali

multicellulari:

Ogni nuova generazione è prodotta nel giro di minuti piuttosto che settimane o mesi

✓ Facili e economici da propagare in un numero elevatissimo in condizioni controllate di

✓ laboratorio

Singoli individui di queste popolazioni sono geneticamente identici perché ogni

✓ popolazione è un clone di cell geneticamente identiche

Cromosoma batterico

= unica molecola di DNA circolare lunga alcuni milioni di nucleotidi (pari a

circa 1 mm) e codificante alcune migliaia di geni

• Cromosoma addensato in struttura detta nucleoide

• non è confinato nel nucleo

• DNA connesso a introflessioni della membrana plasmatica = mesosomi

• Genoma dell’ordine di quale milione di nucleotidi (il più grande 13 mln pb)

(tra i più piccoli 0,5 mln pb)

• Ci sono pochi studi su genomi di batteri con genoma molto piccolo => gli

studi sono orientati a scoprire quale è il genoma minimo che cell deve avere per la

sopravvivenza

• Primo batterio ad avere intero genoma sequenza te è stato Haemophilis influenzae nel 1995

da Craig + Smith

- Circa 1,8 milioni pb

- Circa 1740 geni

• Oggi ci sono 576.932 progetti WGS (Whole Genome

Sequencing) su più di 242.000 batteri

• Nel 2024 ci sono 433.265 genomi di batteri sequenziati nel

GOLD (Genomes OnLine Database) del JGI (Joint Genome

Institute)

Escherichia coli (E.coli)

• È una delle specie principali di batteri che vivono nella parte inferiore di animali a sangue caldo

(uccelli, mammiferi)

• Necessario per digestione corretta di cibo e per produzione di vitamine del complesso B e K

• Forma di bastoncello

• Gram-negativo, non sporigeno

• Cresce alla T di 37°C

• Genoma di circa 4,6 Mb che codifica per 4300 geni

Crescita batterica

• Batteri possono crescere

Terreno liquido

o Terreno solido (in capsule petril, nome dal batteriologo che la inventò) (per addensarlo

o si utilizza agar)

• In condizioni ottimali una cell si può dividere ogni 20 minuti

• Una coltura liquida di E.coli contiene circa 10^9 cell/ml

Analisi genetica dei batteri

• Analisi genetica richiede analisi di mutanti

Nomenclatura fenotipi e genotipi mutanti

Fenotipo: indicato con 3 lettere

o

- prima maiuscola con apice + o – che indica presenza o meno di quel particolare fenotipo

- oppure lettera s o r per sensibilità o resistenza

genotipo: indicato con 3 lettere corsive minuscole

o

• Tre tipologie di mutanti sono utili:

a) Mutanti per la resistenza ad antibiotici

= capaci di crescere in presenta di un antibiotico quale l’ampicillina (Amp) o tetraciclina (Tet)

b) Mutanti nutrizionali / autotrofi

= batteri selvatici in grado di sintetizzare la maggior parte delle sostanze complesse di cui

hanno bisogno a partire da molecole semplici presenti nel terreno (prototrofi) e possono

crescere su terreno minimo, che in seguito a mutazioni generano ceppi incapaci di

sintetizzare in nutriente essenziale e non possono crescere su terreno minimo a meno che

tale nutriente non sia aggiunto a terreno di coltura

c) Mutanti per la sorgente di carbonio

= batteri capaci di utilizzare alcuni substrati come fonti di atomi di carbonio

- Più semplice fonte di carbonio per batteri e glucosio

- Fonti di carbonio alternative possono essere utilizzate da batteri selvatici (wild type)

- Alcuni mutanti perdono questa capacità di usare altre fonti

Terreno selettivo e non (per la selezione dei ceppi)

Selettivo = terreno che permette la crescita di un solo tipo di cellula (selvatica o mutante)

o Non selettivo = terreno in cui tutte le cell batteriche in esame sono capaci di formare

o colonie

Plasmidi

= molecole di DNA non essenziale presenti all’interno delle cell batteriche, la maggior parte

molecole di DNA circolare anche se ne esistono di lineari

• Presenti nella maggior parte delle specie analizzate

• Si replicano indipendentemente dal genoma batterico

• Segregano nella progenie alla divisione cellulare

• Ci sono plasmidi presenti con 50+ copie /cell, altri 1-2

copie/cell

• Contengono info che attribuiscono determinato fenotipo

alle cell batteriche che li ospitano: resistenza ad antibiotici,

produzione di tossine…

• Possono essere rilevate mediante:

- microscopia elettronica

- analisi elettroforetica del DNA batterico su gel d’agarosio di preparazioni di DNA batterico

in cui si è selettivamente purificato il DNA a basso peso molecolare, eliminando così il

cromosoma batterico

• episomi = alcuni plasmidi (come plasmide F) che possono

integrarsi nel cromosoma

• in queste condizioni non si replicano più in modo autonomo ma

in sincronia con cromosoma stesso

• episoma può separarsi da cromosoma e tornare a replicarli

autonomamente sotto forma di plasmide

Struttura plasmidi:

• per la replicazione utilizzano enzimi coinvolti nella replicazione

del DNA batterico

• sequenze presenti nel plasmide:

- ori / origini di replicazione = sequenze proprie che regolano il punto di inizio della

replicazione e possono anche codificare per proteine utili alla replicazione del DNA

plasmidico

- (sequenze per selezione come per la resistenza a

antibiotici)

Sessualità dei batteri

= capacità di alcuni batteri di scambiare materiale genetico tra loro

• Ciò interessante perché:

Ricerche su sessualità batterica hanno dato origine a genetica molecolare (importante

➢ per studi biomedici)

Queste ricerche hanno reso possibile sviluppo delle tecnologie del DNA ricombinante

➢ (ingegneria genetica)

Studio di quanto avviene nei batteri ha dato chiave interpretativa per meglio

➢ comprendere il ruolo della sessualità preso organismi viventi più complessi

Rende possibile comprensione dei meccanismi genetici alla base della resistenza agli

➢ antibiotici nei batteri patogeni

Resistenza ad antibiotici

• Elevata % di batteri isolati da infezioni cliniche sono resistenti a uno o più antibiotici

• Molti antibiotici che una volta erano efficaci ora sono diventati pressoché inefficaci

• Negli USA ogni anno 2,8 mln persone infettate da batteri resistenti e almeno 35.000 persone

milioni

• Nel mondo 1,2 milioni di morti all’anno

• Diffusione di geni di resistenza non è solamente dovuta a nuove mutazioni nel genoma ma a

geni acquisiti mediante DNA mobile

Meccanismi di antibiotico resistenza

a) Ridotta affinità per il bersaglio

= gene che produce bersaglio dell’antibiotico subisce mutazione tale per cui bersaglio

continua aa funzionale,a cnen se con funzionalità ridotta ma non interagisce con antibiotico

b) Iperproduzione del bersaglio

= gene che produce bersaglio subisce mutazione per cui sovraespresso

c) Inattivazione intracellulare dell’antibiotico

= per produzione i enzimi che inattivano antibiotico (beta-lattamasi, cloramfenicolo acetil-

transferasi)

d) Diminuita concentrazione dell’antibiotico nella cellula batterica

= dovuta a produzione di trasportatori di membrana che riconoscono e estrudono antibiotico

dalla cell

e) Sostituzione del bersaglio

= bersaglio dell’antibiotico viene sostituito da un’altra molecola che svolge stesso funzioni

ma che non interagisce con antibiotico

Meccanismi d’azione degli antibiotici

a) Interferiscono con sintesi proteica

b) Agiscono sulla membrana cellulare

c) Agiscono sulla sintesi degli acidi nucleici

d) Agiscono sulla parete cellulare

Trasferimento genico di DNA nei batteri

Trasferimento genico verticale: attraverso scissione binaria

o Trasferimento genico orizzontale = processo nel quale un organismo trasferisce materiale

o generico a un’altra cellula che non è discendente

Comune nei batteri anche tra specie distanti

▪ Si considera come una causa importante nella resistenza a farmaci => Quando cell

▪ batterica consegue tale resistenza può trasferire rapidamente questi geni ad altre specie

Avviene attraverso 3 meccanismi

▪ a) Coniugazione

b) Trasduzione

c) Trasformazione

Trasformazione

= processo attraverso il quale una cell ricevente acquisisce geni da una molecola di DNA presente

nell’ambiente circostante

• 1943 Avery + MacLeld + McCarty:: trasformazione mediata da DNA purificato fu la prima prof

a sperimentale che DNA era materiale genetico

• Inizia con Incorporazione da parte della cell batterica di frammento di DNA Nel mezzo

circostante e termina quando parte di esso sostituisce un frammento corrispondente di DNA fia

presente nel batterio mediante ricombinazione omologa = processo in cui due molecole di DNA

a doppio filamento, che hanno regioni di sequenza nucleotidica altamente simili o identiche

(omologhe), si scambiano segmenti di DNA

1928 Esperimento di Frederick Griffith

uno dei primi a suggerire che che batteri sono in grado di trasferire tra loro info generiche

 attraverso processo noto come trasformazione

• esperimento apre strafa a determ8nazione di quale fosse la natura del materiale genetico

• usa Streptococcus pneumoniae

- ceppo S (smooth): ricoperto da capsula polisaccaridica che lo protegge da attacco sistema

immunitario dell’ospite => in grado di causare polmonite nei topi (ceppo virulento)

- ceppo R (rough): non ha la capsula => non è in grado di causare la polmonite nei tipi (ceppo

avirulento)

1. inietta cellule S vive in topi => contraggono polmonite

2. isola colonie S da tessuti del topo morto

3. inietta cellule R vive in topi => non si ammala

4. isola colonie R da tessuto

5. inietta cell S inattivate da calore in topo => tipo non si ammala

6. non si può isolate colonie di batteri da tessuto

7. inietta cell R con cell S inattivate da calore => topo contrae polmonite

8. colonie S e R isolate da tessuto topo morto

• identifica il fattore di trasformazione

1944 Esperimento di Avery, McCarty, MacLeod

riescono a dimostrare che cosiddetto principio trasformante scoperto nel 1928 da Griffith era

 DNA

1. coltura di cell S

2. coltura di cell R

3. fa estratto di cell S (contiene DNA

con tracce di proteine e RNA)

4. inserisce estratto di cell S in coltura

di R

5. semina quest’ultimo e ottiene

colonie R e poche colonie S

b. 1) Aggiunge proteasi o RNasi a

estratto di cell S

2) introduce estratto nella coltura di R

3) semina quest’ultimo

4) ottiene coloneire R e poche colonie

S

c. 1. Aggiunge DNasi a estratto di cell S

2. introduce estratto a coltura di R

3 semina quest’ultimo

5) ottiene solo colonie R

• DNA trasformante una volta acquisito in modo stabile mediante ricombinazione con una

regione omologa del cromosoma diventa parte integrante dell’info genetica del batterio

ricevente che può quindi acquisire nuove caratteristiche fenotipiche

• Maggior parte specie batteriche, in ores sa di eccesso di DNA esogeno, trasformazione

avverrà con frequenza di 1 cellula trasformata su circa 10^3 cell

Significato biologico / evolutivo della trasformazione

Fonte di nutrienti: DNA esogeno in assenza di trasformazione può essere degradato e

✓ essere usato per i nucleotidi

Diversità genetica: frammento in seguito a trasformazione rende batterio in grado di

✓ svolgere funzioni che priva non riusciva a fare

Riparazioni danni a DNA della cell trasformata

✓

Mappa genetica mediante trasformazione

• Se due geni a e c sono lontani su cromosoma del DNA donatore, poiché esso tipicamente si

rompe in frammenti, saranno presenti frammenti diversi di DNA

Cotrasfromazione / trasformazione contemporanea

• Probabili di una cell ricevente a- c- in selvatica (cioè a+ c+) è 10^3 x 10^3 (si tratta di eventi di

trasformazione indipendenti), si avrà cioè cellula trasformata a+ c+ ogni 10^6 cellule riceventi

• Se due geni a, b sono invece sufficientemente cugini da essere presenti sullo stesso frammento

di DNA del donatore, allora la frequenza sarà simile alla frequenza di cotrasformazione del

gene singolo (10^3)

• Cotrasfromazione di due geni a frequenza maggiore del prodotto della trasformazione dei

singoli geni indica che i due geni sono vicini sul cromosoma batterico

• Non si osserva trasformazione a+ b+ c+ in quanto i tre geni sono troppo lontani per trovarsi si

stesso frammento di DNA

Trasformazione in laboratorio

• Cell batteriche durante fase di crescita espone nei ale possono essere rese competenti = in

grado di acquisire DNA estraneo dall’ambiente

• Per fare ciò si deve permettere a molecole di DNA di attraversare membrana rendendola

temporaneamente permeabile => si usano

- metodi chimici (Cacl2): Ca2+ neutralizza cariche negative repulsive dei fosfati del DNA e

dei fosfolipidi della membrana cellulare, permettendo a DNA di penetrare all’interno della

cellula

- metodi fisici (elettroporazione)

• in lab di solito la trasformazione viene effettuata per veicolare all’interno di cell batteriche i

plasmidi ricombinanti = plasmidi che contengono al loro interno sequenze di DNA esogeno

clonato dai ricercatori

Coniugazione

= processo attraverso il quale avviene scambio di materiale genetico tra due batteri attraverso il

pilus

• scoperta nel 1946 da Joshua Ledeberg e Edward Lawrie Tatum

Plasmide F (F = fertilità)

= molecola di DNA circolare di grosse dimensioni (circa

99.200 nt), ha basso numero di copie per cell e replica una

sola volta per ciclo cellulare

• cell che lo contengono chiamate F+, quelle prive F-

• nella regione tra presenti circa ventina geni che

permettono a plasmide di essere trasferito da cell

batterica a altra mediante coniugazione

• coniugazione avviene tramite pilus = struttura tubulare

• maggior parte dei piccoli plasmidi non è coniugativa

1) complesso relaxosoma si lega a oriT = origine del fattore F

2) enzima relaxase (codificata da Tral) taglia in un unico punto (ori T) un singolo filamento del

fattore F, si lega a estremità 5’ DNA e ne srotola circa 200 nt

3) tale porzione di DNA singola elica è la prima trasferita attraverso pilo nella cell F-

4) trasferimento di DNA sempre accompagnato a replicazione del plasmide F secondo modalità

a cerchio rotante

5) quando trasferimento completo la molecola lineare F diventa circolare nella cell ricevente

6) dopo trasferimento entrambe cell contendono plasmide F e possono fungere da donatrici (F+)

• trasferimento avviene in circa 2 min

• in condizioni di lab poche cell donatrici sono in grado di convertire a F+ un eccesso di cell F- in

poche ore

Coniugazione con cellule Hfr

• cell Hfr (High Frequency of Recombination) = cell in cui si

osserva un’alta frequenza di trasferimento di geni da cell hfr

donatrice a un batterio ricevente, in cui il fattore F si integra nel

cromosoma batterico mediante ricombinazione a livello di

sequenze omologhe

• sequenza di inserzione (elementi IS) presenti su cromosoma

batterico e su fattore F (con seq identica) mediano integrazione

di quest'ultimo

• replicazione e trasferimento DNA cromosomico a esso associato

sono controllati da fattore F e hanno origine in oriT

Hfr x F-

1) origine da oriT

2) prima a essere trasferita sarà una parte di F, poi cromosoma

batterico e poi, teoricamente, la parte rimanente di F

3) nell’accoppiamento con hfr il DNA che si trasferisce non

diventa circolare perché fattore F non si trasferisce

completamente

4) due cell si allontanano ben prima del completamento del

trasferimento dell’intero cromosoma batterico e della parte

finale di F

5) inserzione DNA donatore nel cromosoma ricevente richiede

due eventi di ricombinazione omologa nella cell ricevente

Differenze tra trasferimento di fattore F e un Hfr

- servono 100 minuti per trasferimento intero cromosoma e 2 minuti per fattore F

- durante trasferimento DNA d hfr, accoppiamento si interrompe dopo minuti, prima che intero

cromosoma si trasferisca. Centinaia di geni possono comunque essere trasferiti prima che

cell si separino

- in accoppiamento hfr x F- la cell ricevente rimane F-, in uno F+ x F- la dell rivenete diventa

F+

- nel trasferimento Hfr alcune regioni DNA trasferito possono esser incorporate nel

cromosoma del ricevente, risultato è che alcune cell F- diventano ricombinanti, in ogni caso

genoma Hfr rimane inalterato

Analisi genetica incrocio Hfr x F-

• per identificare riceventi ricombinanti è opportuno eliminare cell donatrici Hfr

• a tal fine è utile usare cell F- che hanno marcatore selezionabile

in accoppiamento Hfr leu+ str-s e F- leu- str-r le cell donatrici possono essere uccide piastra o

dopo accoppiamento su terreno con streptomicina

Mappatura genetica mediante coniugazione interrotta

• mappa genetica può essere otte