Appunti completi Bioinformatica e genomica funzionale

Introduzione alla bioinformatica

La bioinformatica è l'integrazione di matematica, statistica e metodi computazionali per l'analisi di dati biologici, biochimici e fisiologici. Consiste nello studio di biologia e medicina attraverso il contributo dell'informazione. È una disciplina molto ampia che comprende ad esempio l'analisi di sequenze, la quantificazione di esperimenti sull'abbondanza delle specie molecolari, una parte di genetica, ecc.

Le nuove biotecnologie producono una grande quantità di informazioni impossibili da analizzare manualmente, dunque la bioinformatica si è sviluppata per produrre nuove informazioni per usi biologici e clinici. Se inizialmente si trattava di organizzazione di dati e creazione di banche dati, ora si occupa di analisi dei dati.

Il genoma umano

L'Homo sapiens ha una sequenza di 3 miliardi di basi di DNA uguale per tutte le cellule dell'organismo; le cellule si specializzano in modo diverso in quanto diverse sezioni di DNA sono attive, ossia grazie alla regolazione genica: non è solo la sequenza delle basi a determinare il tipo di cellula, ma soprattutto il flusso di informazione che la cellula utilizza. Questa modulazione avviene sia nello sviluppo di un individuo, sia durante la reazione a uno stimolo.

La parte codificante del genoma (la parte tradotta in proteina) è molto piccola, la parte restante ha diverse funzioni ancora non note, ma in generale gestisce la regolazione. Durante la replicazione del DNA possono avvenire delle mutazioni: alcune non hanno risvolti, mentre altre determinano dei fattori di rischio per determinate patologie.

Struttura del DNA

La molecola del DNA consiste in due catene complementari costituite da nucleotidi. Ciascun nucleotide è formato da un gruppo fosfato, uno zucchero e base azotata (parte che varia e che reca l'informazione). Le basi sono quattro e possono essere distinte in base all'ingombro in:

• Purine: di cui fanno parte Adenina e Guanina, composte da un doppio anello;
• Pirimidine: di cui fanno parte Timina e Citosina, composte da un singolo anello.

I nucleotidi sono tenuti insieme da legami fosfodiesterici tra specifici atomi di carbonio, in particolare tra il carbonio 3 e il 5. La 5' è l'estremità iniziale mentre la 3' è quella finale. Nel caso di filamento doppio le catene sono complementari (A+T, C+G) e i due filamenti possono essere letti da entrambe le parti perché sono equivalenti e antiparalleli.

Cromosomi

I cromosomi sono strutture filamentose e allungate costituite da cromatina e visibili solamente durante certe fasi del ciclo cellulare. Sono 22 paia di cromosomi autosomici mentre il 23° paio sono di tipo sessuale (XY maschio e XX femmina). Quindi 22+1+1= 24 tipi possibili di cromosoma e quindi 23 paia. Paia perché abbiamo il doppio di tutti i cromosomi autosomici.

Il DNA per essere sistemato in ciascuna cellula deve essere organizzato in maniera molto efficace ed efficiente dal momento che la doppia elica srotolata sarebbe lunga 2 m. La doppia elica si avvolge attorno a delle proteine chiamate istoni (parti tondeggianti fatte da proteine che fungono da rocchetti) ogni 150 basi e questo insieme va a formare il nucleosoma. I nucleosomi poi si avvicinano a formare una fibra ordinata in cui tutti i nucleosomi avvicinati vanno a rendere molto efficiente l'impaccamento del DNA. A questo punto la fibra (10 nm di spessore) si avvolge ulteriormente con delle anse e con un’ulteriore condensazione sino ad arrivare al cromosoma.

La disposizione del DNA nello spazio influisce notevolmente sulla sua funzione: se una porzione è impaccata, verrà più difficilmente tradotta in RNA.

Dal DNA al RNA alle proteine

Il dogma fondamentale della biologia molecolare dice che il flusso di informazione parte dal DNA da cui viene trascritto RNA (copiando solo alcune parti) e, laddove codificante, viene formata una proteina. Quest'ultima in particolare perché solo il 2% del genoma è codificante. I geni (ovvero le parti che vengono trascritte ed eventualmente tradotte) sono tipicamente l'alternanza di esoni (parti che vengono conservate) e di introni (parti che dopo la trascrizione vengono rimosse). L’operazione che la cellula fa di eliminare gli introni e assemblare gli esoni si chiama splicing.

Alle estremità di ogni gene è presente la UTR (untranslated region) ossia delle parti degli esoni che viene mantenuta dopo lo splicing, ma non viene tradotta. La complessità dell'Homo sapiens non è da ricercarsi nel numero dei geni codificanti, che non sono in quantità molto maggiore rispetto a creature semplici, ma nello splicing alternativo. Questo prevede infatti che un gene possa essere processato e assemblato in modi differenti: a partire da un'unica sequenza genica si possono ottenere diversi trascritti e differenti isocromi.

Proteine simili possono provenire dallo stesso gene attraverso un differente assortimento delle sequenza istoniche. Il codice genetico a rigore associa ad ogni tripletta un AA. 64 triplette x 20 AAs e 3 codoni (triplette di stop). Generalmente la sequenza inizia dalla tripletta AUG (o meglio la traduzione) che corrisponde all’AA Metionina. Il codice genetico è degenerato per il fatto che non c'è corrispondenza univoca tra AAs e triplette (un AA può essere codificato da più triplette).

Geni codificanti

Solo il 2% del genoma codifica per proteina e questo è un aspetto molto rilevante: vuol dire che la funzione che noi abbiamo considerato principe non è la parte che occupa più informazione all'interno del genoma. Dopo che si è sequenziato il genoma si parlava di Junk DNA (spazzatura) per le parti non codificanti considerate inutili. Chiaramente essendoci hanno una loro necessità.

In un organismo superiore come Homo sapiens la parte non codificante è preponderante e man mano che andiamo a considerare organismi meno evoluti la parte non codificante rimpicciolisce. Evidentemente anche questo è un modo per spiegare la complessità dell'organismo. Nell'Homo sapiens il numero di geni codificanti è di 20.000.

Progetto genoma umano

(1990): con lo scopo di scoprire la sequenza del genoma umano, portato a termine in 15 anni. Da qui sono nati altri progetti per studiare la variabilità della sequenza interindividuale. Il progetto ha fornito una sequenza ma non ha fornito le regole per leggere e codificare questo lungo messaggio. Nella realtà se sequenzio il genoma posso trovare fattori di rischio per una patologia ma anche fattori protettivi sulla stessa patologia.

Struttura delle proteine

• Primaria: catena lineare di AAs;
• Secondaria: caratterizzata da legami idrogeno. Le più comuni sono le conformazioni a α elica e a β elica;
• Terziaria: risultante dal ripiegamento;
• Quaternaria: unione di più strutture terziarie composte da differenti catene lineari.

Le proteine sono le molecole che realizzano tutte le funzioni di cui abbiamo bisogno tra cui il sistema immunitario, struttura, gli enzimi, proteine di canali. Quindi sono gli attori molecolari del sistema. La struttura condiziona la funzione. Quando si traduce la sequenza di DNA si ottiene la struttura primaria ma solo la struttura finale determina la funzione della proteina. Quando qualcosa va storto nella sequenza viene alterata la funzione come nel caso dell'anemia falciforme in cui c'è la sostituzione di una A con una T e quindi viene codificata una valina anziché un acido Glu e questo determina un cambio nella forma della proteina e porta i globuli rossi (a causa dell'emoglobina alterata) ad avere una forma a falce che li rende meno efficienti nel trasporto dell'ossigeno.

Database

Le informazioni riguardanti il genoma sono racchiuse in banche dati di database primari, ossia che mettono a disposizione dei dati sperimentali.

• Per quanto riguarda la sequenza dei nucleotidi:
  • EMBL (EU)
  • GenBank (USA)
  • DDBJ (JP)
• Per quanto riguarda le proteine:
  • UniProtKB, per la sequenza amminoacidiche in cui per ognuna è riportato l'insieme delle conoscenze che si hanno su quella proteina. Ha due sezioni:
    • Swiss-Prot che contiene le informazioni verificate;
    • TrEMBL dove sono presenti i record in attesa di essere verificati, se si rivelano inediti vanno a popolare Swiss-Prot.
  • RCSB, sono presenti le proteine la cui struttura è stata risolta. In questo caso il database è molto ridondante.

Queste 5 sono banche dati primarie in quanto contengono il dato primario, sperimentale, sequenze e strutture. Poi ci sono le banche derivate specializzate.

Analisi di sequenze: algoritmi di allineamento ottimo

Operazione di allineamento = operazione ricorrente in genomica per mettere a confronto sequenze per poterne caratterizzare la funzione. Il confronto di sequenze permette di approfondire la conoscenza della struttura proteica e conoscerne quindi anche la funzione. Approfondire la conoscenza di sequenze note per comprendere meglio la funzione di quelle incognite.

Omologia = proprietà binaria che rappresenta la discendenza di due sequenze da uno stesso ancestore (proprietà qualitativa). Può essere ulteriormente specificata in:

• Ortologia: stesso ancestore ma attuale appartenenza a specie diverse (funzioni simili).
• Paralogia: stesso ancestore ma attuali funzioni diverse nello stesso genoma (funzioni diverse).

Similarità = proprietà quantitativa (%) per indicare quanto due sequenze si somigliano (quantità di equivalenze).

Dot Plot

Per mettere a confronto due sequenze si può usare il DOT PLOT ovvero una rappresentazione intuitiva con diagramma a tabella che evidenziano le corrispondenze. Si può lavorare su un singolo nucleotide o su finestre (confronto più flessibile). Per valutare quanto due sequenze sono simili è indispensabile avere uno schema di punteggio per quantificare l’allineamento considerato (Es. +1 per caratteri identici, -1 per caratteri differenti e gap).

Valutazione dell'allineamento

Due sono gli algoritmi ottimi per studiare l'allineamento di due sequenze. Viene detto ottimo quando garantisce la miglior soluzione possibile, ovvero non esiste un altro modo di allineare le sequenze che mette in luce un punteggio maggiore.

• Allineamento globale (o algoritmo di Needleman-Wunsch): due sequenze di lunghezza comparabile sono allineanti in modo tale da trovare la migliore similarità tra le due sequenze intere.
• Allineamento locale (o algoritmo di Smith-Waterman): due sequenze sono allineanti in modo tale da trovare la migliore somiglianza tra sub-sequenze.

Esempio. GAATC e CATAC come possono essere allineate?

Allineamento globale

1. Bisogna identificare un punteggio: gap = -4 e matrice di sostituzione
   • A C G T
   • A 10 -5 0 -5
   • C -5 10 -5 0
   • G 0 -5 10 -5
   • T -5 0 -5 10
2. Produco una matrice per inizializzare il procedimento:
3. Riga 2 e colonna 2: Inserisco i valori di -4 per gli eventi di Gap, aumentando il numero di Gap scorrendo a dx e in basso.
4. Colonna 3: CG considero la corrispondenza tra basi, per riempire AG valuto i 3 movimenti (verso il basso e verso dx corrispondono ad inserimenti di Gap e quindi a -4, 0 in diagonale per l'allineamento della base in sequenza AG) ottenendo -4,-9 e -12 e scelgo il punteggio massimo per completare la cella -4.
5. Si completa la colonna scegliendo sempre tra le 3 relative opzioni disponibili.

Il punteggio ottimo globale è unicamente quello presente nell'ultima casella in basso a dx, 17. Ripercorro a ritroso i percorsi delle frecce di spostamento (a volte possono essere più frecce) da 17 a 0: freccia diagonale significa corrispondenza di basi (base sx e base alto), spostamento verticale (Base sx, Gap alto) e orizzontale (Base alto, gap sx) prendo una base con un Gap. L’allineamento ottimo non è uno solo:

• GA-ATC e CATA-C
• GAAT-C e CA-TAC
• GAAT-C e C-ATAC
• GAAT-C e -CATAC

Non esiste perciò un modo migliore di allineare le sequenze per ottenere un punteggio maggiore di 17. Devo riportare tutti gli allineamenti!

Cosa vuol dire avere un gap nella soluzione? L’idea è che vogliamo mettere in corrispondenza le sequenze nel miglior modo possibile e questo a volte implica il saltare delle basi (porzione di sequenze) perché magari in una parte più distante troviamo un pezzo di sequenza che è simile e può avere una corrispondenza migliore. Nelle sequenze biologiche trova un grande riscontro perché le sequenze non sono rigidamente simili: se inserzione c'è una base in più rispetto all'altra sequenza, se delezione c'è una base in meno rispetto all'altra sequenza.

Il punteggio, essendo assegnato dall’utente, è un grado di libertà che assegna variabilità ai risultati. Si perde apparentemente quindi in oggettività e, per ovviare a questo problema, sono stati inseriti in letteratura degli schemi di punteggio.

Analiticamente

• x e y = sequenze da allineare
• F = la matrice di procedura
• s = la matrice di sostituzione
• d = il gap lineare di penalità
• Si prende il max tra 3 opzioni (nel sistema rispettivamente diagonale, verticale e orizzontale)

Allineamento locale

L’unica differenza con l’allineamento globale viene rappresentata dalla quarta opzione data dalla presenza dello zero, indicando che non possono esserci valori negativi nelle celle. Vado a inizializzare con 0 la prima riga e la prima colonna; poi vado a riempire la cella con le stesse regole di prima. Nel momento in cui viene identificata una quarta opzione il punteggio massimo è semplicemente il valore massimo all’interno della tabella, a prescindere dalla posizione da esso occupata (non più ultima cella in basso a dx). Anche qui viene poi ripercorso l'andamento delle frecce a ritroso e solitamente copre solo una porzione delle sequenze (ove presenti frecce).

NB. Questi algoritmi possono essere usati sia su sequenze nucleotidiche (4) sia su sequenze amminoacidiche (20).

Matrici di sostituzioni: BLOSUM

Una matrice di sostituzione ha il compito di valutare il peso delle sostituzioni di AAs differenti, valutando il loro grado di similarità biologico: sostituzioni più plausibili in natura hanno un punteggio positivo ed elevato. Per quanto riguarda BLOSUM, il procedimento prevede di analizzare sequenze amminoacidiche in relazione evolutiva tra loro e valutare i punteggi in base alle sostituzioni presenti in natura. Dalle sequenze vengono ottenuti dei multi-allineamenti e ne sono estratti dei blocchi da valutare (parte di allineamento privo di gap e con un certo grado di conservazione).

Ciò provoca un problema di circolarità in quanto i blocchi derivano da un allineamento, ma questo deriva da una matrice di sostituzione, che deve essere una condizione iniziale: alla prima iterazione si applica uno schema per cui il match=1 e mismatch=0. Si basa quindi sull’idea di collezionare un gran numero di sequenze di proteine per valutare le sostituzioni più ricorrenti e verosimili in natura.

Esempio. Abbiamo 6 sequenze e 4 posizioni, andiamo a contare l’occorrenza dei vari caratteri quindi 24 in tutto divise in 14 A, 4 B e 6 C; il procedimento per ottenere la BLOSUM prevede di calcolare le frequenze di appaiamento. Guardando quindi gli allineamenti in direzione verticale andiamo a calcolare l’occorrenza delle diverse coppie possibili: andiamo a determinare il numero di possibili appaiamenti (4 posizioni * 6 coppie / 2 elementi) e andiamo a calcolare la frequenza di ciascun tipo di appaiamento (AB= nella prima posizione si allinea 5 volte, 3 sulla terza posizione e 0 sulle altre 2). I numeri vengono elaborati calcolando le proporzioni attese ovvero il prodotto delle frequenze dei singoli simboli (se le basi sono 6 diverse moltiplico anche per 2); le proporzioni attese vengono confrontate con quelle calcolate facendo 2 volte il logaritmo in base due delle proporzioni osservate fratto le proporzioni attese.

Quest’operazione ci restituisce un valore che viene arrotondato all’intero più vicino che ci restituisce la matrice di sostituzione. La matrice ottenuta è simmetrica e conterrà i punteggi che dobbiamo utilizzare negli algoritmi come quelli ottimo ecc.

La matrice BLOSUM reale è sempre simmetrica; il significato biologico dei punteggi ci dice che un punteggio positivo relativamente elevato riguarda una sostituzione che è comune, viceversa punteggi negativi sono relativi a sostituzioni tra acidi differenti rispetto alle loro proprietà chimico-fisiche e quindi meno osservate in natura perché vanno a variare le caratteristiche strutturali e quindi funzionali.

La matrice BLOSUM è sempre correlata ad un numero che è la % che abbiamo utilizzato per raggruppare sequenze con identità superiore alla soglia stessa. Andando a raggruppare le sequenze più simili quello che otteniamo è una collezione di sequenze molto vicine tra loro. Se la soglia è invece bassa otteniamo una collezione di sequenze più distanti e meno simili (livello di identità più basso). Le conseguenze sull’applicazione è che la BLOSUM con un numero alto sarà adatta a confrontare sequenze simili tra loro.

Esempio. Se abbiamo BLOSUM85 sequenze con 86% di similarità vengono contate come una (cluster) mentre con 84% di similarità vengono contate come distinte.

NB. Identità e similarità sono proprietà quantitative. Identità=numero di AAs identici.

BLAST

L’allineamento ottimo ci garantisce la soluzione migliore possibile rispetto al punteggio stabilito quindi alla matrice di sostituzione. In generale gli algoritmi ottimi sono molto onerosi dal punto di vista computazionale e in particolare l’utilizzo pi...