Appunti Biotecnologie nella diagnostica di laboratorio e fondamenti di statistica

APPLICAZIONI CZE IN LABORATORIO CLINICO

- Separazione proteine - Separazione piccoli ioni

- Separazione emoglobine - Monitoraggio farmaci

- Separazione proteine urinarie - Monitoraggio droghe d’abuso

- Separazione proteine liquidi biologici - Analisi cellulare

La separazione con elettroforesi capillare è una

separazione splendida con quantizzazioni

perfette. La risoluzione rispetto all’HPLC non è

paragonabile, perché l’elettroforesi capillare

ovviamente è migliore. L’HPLC è infatti una tecnica

più grossolana rispetto alla separazione

elettroforetica.

Possiamo utilizzarla anche per separare le varanti

emoglobiniche: le separazioni sono perfette.

Guardare la differenza con l’HPLC in basso a

destra.

L’elettroforesi capillare è usata per la diagnosi di

talassemia. Oppure si può sequenziare, ma

bisogna conoscere il gene mutato; quindi,

quando c’è un sospetto di talassemia si fa prima

la ricerca del profilo elettroforetico e poi,

eventualmente, il sequenziamento. In a vediamo

il soggetto normale, in b il pz con tratto beta-

talassemico. 46

Un aspetto rivoluzionante è l’uso dell’elettroforesi

dosare l’emoglobina glicata.

capillare per

Il glucosio nell’arco della giornata varia, quinid farne il

monitoraggio è complicato, quindi a volte si trova normale

anche in un pz diabetico, quindi sotto la soglia renale.

Quindi si deve misurare più volte durante la giornata, ma

non è una cosa pratica. Si trova la soluzione grazie a un

medico di laboratorio

Un ricercatore in un lab sospettava che un pz diabetico avesse una

variante di Hb, ovvero l’Hb fetale, non presente nell’adulto. Ha fatto

l’elettroforesi e ha caricato l’Hb fetale, il campione normale e quello

diabetico. Ha subito visto un comportamento anomalo: nel terzo ci

sono 2 bande separate da una piccola parte. Ma in alto non abbiamo

due bande, ma una grande con una specie si cappuccio. Nel normale

anche qui c’è un’ombra, un cappuccio ma più sbiadito. Quindi c’è

qualcosa presente sia nel campione diabetico che nel normale. Non

ha trovato quindi la variante emoglobinica fetale. Tutte le proteine vanno incontro a glicosilazione, anche nel

soggetto normale. Il cappuccio che vediamo nell’elettroforesi

è perché le proteine circolanti si glicosilano. Il campione

diabetico aveva la glicemia troppo alta, quindi aveva tantissimi

Hb glicata → un cappuccio maggiore di quello presente

normalmente.

Questa diagnosi è diventata fondamentale per

stabilire un pz diabetico. 47

Perché proprio l’Hb? La glicazione avviene in tutte le

proteine ma, per poterla quantificarla bene in un certo

arco di tempo, non può essere una cosa occasionale, ma

deve stare lì per tanto tempo: l’Hb ha un’emivita di 6-12

settimane → posso monitorare i livelli del glucosio in 2-3

mesi. Non sempre, infatti, trovo glicosuria con le urine,

magari dipende dall’orario in cui le ha raccolte. Quindi,

l’unico modo per un nefrologo di stabilire se un pz ha una

giusta compliance con la terapia è stabilire l’Hb glicata. In

questo modo sa quanto il pz ha mangiato negli ultimi 3

mesi. Se il pz è sicuro di aver seguito la dieta, allora

occorrerà cambiare stile di vita e dieta → altrimenti si può perdere la vista, problemi

ad arti inferiori ecc.

La tabella mostra che i livelli di Hb glicata sono sempre presenti, anche nei sani. Ma

tra il 6 e il 7% vieni considerato a rischio di diabete.

L’uso di tecniche come quella dell’elettroforesi capillare

per quantificare l’Hb glicata è importante, perché ho tanti

campioni da analizzare. Esistono anche sistemi POCT così

che la valutazione viene fatta a casa. La riproducibilità del

POCT sull’Hb glicata non è a livello della riproducibilità e

dell’attendibilità della valutazione in elettroforesi

capillare in lab.

DETERMINAZIONE DELLA TRANSFERRINA CARENTE IN CARBOIDRATI

Il dosaggio della sialo è fondamentale per capire se il pz sta abusando di alcol. La mancanza di acido silico, dovuto alle

aldeidi che vengono prodotte dal catabolismo dell’alcol impediscono all’acido sialico di attaccarsi → aumento di asilo,

disialo e tetrasialo.

L’acido sialico non si attacca alla transferrine, quindi aumentano le transferrine che non hanno attaccate l’acido sialico

nei soggetti che abusano di alcol. 48

Si evidenziano benissimo le separazioni con l’elettroforesi

capillare.

I tecnici preferiscono l’HPLC perché lo conoscono meglio,

ma non c’è paragone tra la precisione dei due metodi.

ESEMPIO DELL’ELETTROFORESI DELLE PROTEINE PLASMATICHE.

Nonostante la risoluzione è buonissima, si vedono 10

proteine, ma noi ne abbiamo 100 mila nel sangue.

Stiamo cercando di aumentare le informazioni che ci

provengono da un analisi delle proteine plasmatiche.

Posso usare metodi antigene-anticorpo, ma gli ELISA a

volte danno tanti risultati che non sono stabili e

riproducibili → la proteina è grande; quindi, le

interazioni possono venire in punti diversi, tante

proteine si assomigliano (certi anticorpi possono

riconoscerne altre).

Quindi un anticorpo reagisce prima con la mia banda,

ma poi con altre bande. Nonostante a volte è necessario

tenere l’anticorpo per più tempo per vedere meglio il

risultato e questo porta a ibridazioni non specifiche. Queste analisi in elettroforesi capillare hanno tempi più brevi, un

minor lavoro, ma non si adattano ad un lab di ricerca, ma a quelli di

routine. 49

L’elettroforesi capillare può fare anche separazioni

di peptidi. Se faccio un digerito triptico (digerisco le

proteine con tripsina) e ho tanti frammenti triptici,

questi vengono visualizzati in elettroforesi capillare.

Quando i frammenti di proteina vengono analizzati

in elettroforesi capillare, per poi riconoscerli e dire

che appartengono ad una proteina devo ionizzare il

campione e posso metterli in uno spettrometro di

massa, che mi da la sequenza dei peptidi nel

campione. Devo però creare degli adattamenti: i tamponi che uso

per le proteine sono ionici, nell’HPLC uso acetometile,

etanolo, ecc più compatibili con lo spettrometro di

massa. Quindi l’interfaccia elettroforesi capillare-

spettrometro di massa non è usata perché è difficile

rendere compatibile i due strumenti: uno usa solventi

ionici, altri solventi organici.

A sx elettroforesi capillare a dx spettrometro di massa. Sono piccoli.

È una tecnica ad alta sensibilità, risoluzione, velocità di analisi

elevate ma c’è il problema dei tamponi, necessari per separare

in elettroforesi capillare. C’è molta più cultura sull’HPLC

piuttosto che sull’elettroforesi capillare, quindi viene

comunque fatta più la prima tecnica. 50

HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY) LEZIONE 5 – 31. 10

filtro pre-colonna,

Il e la sono le cose fondamentali di un

HPLC, perché svolgono una funzione protettiva, evitando

danneggiamenti della colonna analitica, per l’eventuale

presenza di solidi sospesi nel solvente.

Solvente e sostanza in esame vengono iniettati ad un alta

pressione, che serve per farli passare dall’iniettore alla

precolonna e poi alla colonna di separazione. C’è quindi

bisogno di una pompa che pompi i solventi e il campione.

I componenti separati vengono quindi convogliati nella zona

di misura del rivelatore e quindi in un recipiente di raccolta

degli scarti.

Il segnale prodotto dal rivelatore, opportunamente elaborato, viene registrato.

Processi applicabili:

Cromatografia di ripartizione,

- utile per determinare specie molecolari con PM < 10 Da, polari, non ioniche).

3

Cromatografia di adsorbimento,

- per determinare specie molecolari con PM < 10 Da, non polari).

3

Cromatografia a scambio ionico,

- per determinare specie molecolari con PM < 10 Da, ioniche).

3

Cromatografia di permeazione gel,

- per determinare specie molecolari con PM > 10 Da, non polari).

4

Cromatografia di gel filtrazione,

- per determinare specie molecolari con PM > 10 Da, polari).

4

Come scegliamo le colonne?

polarità

La è una proprietà delle molecole per cui una molecola presenta una carica parziale positiva su una parte della

molecola e una carica parziale negativa sulla parte opposta di essa. Le molecole che non presentano il fenomeno di

polarità sono dette apolari o non polari.

Esempi di molecole polari: acqua, ammoniaca, anidride solforosa, acido solfidrico, etanolo, NaCl.

Esempi di molecole apolari: metano, etilene, toluene, la

maggior parte delle molecole organiche.

Il grafico porta a comprendere come scegliere le colonne per

separare ciò che voglio andare a vedere, a cercare nel mio

campione. Avrò le sostanze messe in un grafico in questo

senso, con polarità crescente. Avrò da un lato le molecole

insolubili in acqua da portare in soluzione per un solvente, e

sono sostanze non polari, mentre dall’altro lato avrò le

sostanze solubili in acqua e ioniche. Al centro avrò tutte le

sostanze che sono polari ma che non sono ioniche. Queste

aree vengono coperte da colonne e cromatografie diverse.

Tutte le sostanze non polari potranno essere separate per

adsorbimento oppure in parte per ripartizione.

Tutte le sostanze solubili in acqua per lo scambio ionico e per

ripartizione. 51

Al centro tutte le sostanze polari ma non sono ioniche, potranno essere separate utilizzando una cromatografia di

ripartizione. Le cromatografie in gel permeazione si usano per separare le sostanze non polari, mentre quelle gel

filtrazioni per separare le sostanze grosse polari.

Abbiamo la possibilità di separare utilizzando tecniche di colonne che abbiano come principio l’adsorbimento,

ripartizione, scambio ionico, esclusione o affinità.

Meccanismi della separazione:

Questo avviene perché sfruttiamo le interazioni dei nostri elementi da separare con elementi strutturali della colonna.

Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non

fosse non ci sarebbe ritenzione nella fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo

le seguenti interazioni: i legami a idrogeno, le interazioni dipolo-dipolo, le forze di van der Waals, formazione di composti

di interazione e interazioni steriche. In tutte queste interazioni svolge un ruolo decisivo la polarità delle due fasi. Spesso

possono essere presenti p