Appunti Biologia e genetica

Meccanismi di replicazione e struttura del DNA

Modelli di replicazione del DNA

Semiconservativa: Ad ogni ciclo di replicazione la doppia elica si apre e le cellule figlie avranno un filamento vecchio ed uno nuovo, con lo stesso corredo genetico. Questo modello è l'unico possibile, e sfrutta la capacità del DNA di denaturarsi sintetizzando una copia di sé stesso.

Dispersiva: In questo modello si hanno frammenti vecchi e frammenti nuovi all'interno dello stesso filamento; è un tipo di duplicazione ad alto rischio di errori.

Esperimento di Meselson-Stahl (1958)

L'esperimento di Meselson-Stahl è stato fondamentale per determinare il meccanismo semiconservativo di duplicazione del DNA. Meselson e Stahl fecero crescere dei batteri Escherichia coli in un terreno di coltura ricco dell'isotopo pesante N15. L'utilizzo dell'azoto non era casuale, ma fu scelto poiché essendo presente nelle basi azotate, i batteri una volta cresciuti prendevano l'azoto dal terreno di coltura.

Questi batteri metabolizzarono N15, che si introdusse in molte molecole biologiche, tra cui le basi azotate del DNA. In questo modo il DNA presente nei batteri risultava un "DNA pesante", poiché inglobava atomi di azoto più pesanti della norma. Alcuni batteri furono prelevati e da essi venne estratto il loro DNA, per aggiungerlo ad una provetta contenente una soluzione concentrata di cloruro di cesio e centrifugarla. In queste condizioni, nella provetta si formò un gradiente di densità, perché il cloruro di cesio tende a concentrarsi verso il fondo. Una volta formato il gradiente di densità, il DNA migra per fermarsi nella regione della soluzione con densità uguale alla sua. Ciò che si vide sperimentalmente fu una banda verso il fondo della provetta.

A questo punto, alcuni batteri furono trasferiti dal primo terreno di coltura ad un nuovo terreno, in cui era presente N14. Trascorsi 20 minuti, tempo necessario per la formazione di una nuova generazione di batteri, alcuni batteri furono prelevati dal terreno standard per estrarre il loro DNA. In seguito ad una centrifugazione, si ottenne un'unica banda posta in posizione superiore rispetto a quella del caso precedente: il DNA era quindi più leggero. Questo metodo fu fondamentale poiché permise di separare due molecole con peso molto simile, capendo quale fosse la più leggera.

Esperimento di Griffith (1928)

L'esperimento di Griffith fu uno dei primi esperimenti a suggerire che i batteri sono in grado di trasferire informazioni genetiche mediante il processo della trasformazione. L'ufficiale medico inglese Frederick Griffith stava studiando il batterio pneumococco, uno degli agenti patogeni della polmonite umana, per sviluppare un vaccino contro questa malattia che al tempo, prima della scoperta degli antibiotici, mieteva molte vittime.

L'esperimento dimostra che un agente chimico non vivente presente nel ceppo virulento del batterio pneumococco è responsabile della morte del topo. Questo agente chimico è in grado di trasferirsi e trasformare geneticamente i batteri non virulenti della forma virulenta.

Il ceppo S (smooth) era costituito da cellule che producevano colonie a superficie liscia. Essendo ricoperte da una capsula polisaccaridica, queste cellule erano protette dagli attacchi del sistema immunitario dell’ospite. Se iniettate in topi di laboratorio, esse si riproducevano e provocavano la polmonite (il ceppo era quindi virulento). Il ceppo R (rough) era costituito da cellule che producevano colonie con superficie irregolare, prive di una capsula protettiva e non virulente.

Era già noto dai tempi di Pasteur che il calore era in grado di rendere innocue le colture batteriche, così Griffith inoculò in alcuni topolini degli pneumococchi S uccisi dal calore e osservò che i batteri erano disattivati, cioè incapaci di produrre l’infezione. Quando però Griffith somministrò a un altro gruppo di topi una miscela di batteri R vivi e batteri S uccisi dal calore, notò che gli animali contraevano la polmonite e morivano. Esaminando il sangue di questi animali, Griffith lo trovò pieno di batteri vivi, molti dei quali dotati delle caratteristiche del ceppo virulento S; egli concluse che in presenza degli pneumococchi S uccisi, alcuni degli pneumococchi R vivi si erano trasformati in organismi del ceppo virulento S.

Struttura tridimensionale del DNA

La struttura tridimensionale delle molecole di DNA è stata descritta nel 1953 da Watson e Crick. Proposero che il DNA è costituito da due catene polinucleotidiche avvolte a spirale in senso destrogiro, formando una doppia elica. Definirono anche che nelle molecole di DNA ci fossero uguali quantità di adenina-timina e guanina-citosina. La doppia elica è stabilizzata da due tipi di interazioni:

• Legami idrogeno tra le coppie di basi, che sporgono da ciascuna delle due catene. Le basi devono presentare una corretta disposizione dei gruppi donatori e accettori di legami idrogeno. Ciò si verifica solo se adenina si trova di fronte a timina e guanina si trova di fronte a citosina, formando le coppie di basi complementari (A-T e G-C).
• Le forze di van der Waals tra basi sovrapposte, con molecole delle basi piatte che possono creare estese interazioni.

Le due catene hanno direzioni opposte, poiché dove troviamo estremità 5’, nell’altra catena troviamo estremità 3’ (andamento antiparallelo). La sequenza nucleotidica di una catena della doppia elica è libera, perché in ogni posizione può essere presente uno dei quattro nucleotidi che costituisce il DNA; tuttavia, una volta definita la sequenza di una delle due catene, la sequenza dell’altra è completamente vincolata, in quanto deve presentare le basi complementari a quelle presenti sulla catena opposta. Le due catene hanno quindi sequenze diverse, ma complementari.

Duplicazione del DNA

La duplicazione del DNA è bidirezionale e avviene mediante bolle di replicazione. L’innesco che rende disponibile estremità 3’ è un frammento di RNA primer, sintetizzato da DNA primasi, successivamente rimosso. Dato che DNA polimerasi può sintetizzare il DNA solo in direzione 5’-3’, soltanto il filamento parentale con estremità libera 3’ può essere copiato in modo continuo; l'altro filamento viene invece copiato in direzione 3’-5’, replicandosi per frammenti di Okazaki (brevi catene nucleotidiche che si formano durante la duplicazione di una molecola di DNA sul filamento con estremità libera 5’) man mano che DNA polimerasi avanza svolgendo la doppia elica, grazie all’apertura della forcella di replicazione. I frammenti di Okazaki sono poi uniti da DNA ligasi, formando l'intero filamento complementare allo stampo parentale.

Ruolo degli istoni

Gli istoni sono proteine associate al DNA, coinvolte nella determinazione della struttura cromosomica ed espressione genica. Possiamo suddividere gli istoni in cinque categorie: H1, che forma interazione tra nucleosomi, e H2A-H2B-H3-H4, che formano i nucleosomi. Il ruolo strutturale degli istoni è determinato dalla loro capacità di immagazzinare e condensare il DNA, raggruppando la lunga molecola in un breve ammasso di cromatina detto nucleosoma, primo livello di condensazione del DNA. Esso è costituito da un core, formato da tanti giri di DNA avvolti attorno ad un ottamero proteico, costituito da quattro coppie di unità istoniche differenti.

Sequenza genica e splicing

La sequenza di DNA che costituisce il gene per la sintesi proteica presenta, al suo interno, altre sequenze ripetute di nucleotidi, chiamate introni, che non vengono utilizzate per codificare gli amminoacidi da inserire nella proteina. Il gene è perciò formato da sequenze nucleotidiche che codificano gli amminoacidi, chiamate esoni, intervallate da sequenze di introni non codificanti. Il processo di rimozione degli introni è detto splicing, condotto da RNA messaggero.

Struttura e funzione dei cromosomi

Il DNA, insieme a diverse proteine, si organizza in una struttura detta cromosoma. I cromosomi sono 46 molecole di DNA duplicate e spiralizzate, visibili solo durante la divisione cellulare. Sono costituiti da cromatina, contenuto granulare del nucleo formato da fibre contenenti DNA e proteine. Quando una cellula non è in divisione, la cromatina si trova sotto forma di lunghi filamenti. Esiste eucromatina, regioni attive poco condensate con sequenze trascritte, ed eterocromatina, regioni silenziate molto condensate con elementi ripetitivi. L’impalcatura della cromatina è formata da proteine non istoniche, dotate di carica parzialmente negativa.

RNA e sintesi proteica

Il secondo tipo di acido nucleico è l'RNA, coinvolto nel processo di sintesi proteica. Ogni RNA è caratterizzato da una propria sequenza nucleotidica, specificata dalla sequenza nucleotidica del segmento di DNA che costituisce il gene per quel RNA; uno dei filamenti di DNA che costituisce il gene, in base alla legge di complementarità delle basi, funge da stampo e seleziona i nucleotidi del RNA. RNA è composto da una singola catena polinucleotidica, che può ripiegarsi a formare tratti a doppio filamento intramolecolare. Esistono tre tipi di RNA:

• RNA ribosomiale: Entra nella costituzione dei ribosomi, coinvolti nella sintesi proteica.
• RNA transfer: Trasportatori degli aminoacidi per la sintesi proteica.
• RNA messaggero: Deputato al trasferimento di informazioni per la sequenza di aminoacidi delle proteine sintetizzate, nel processo di sintesi proteica.

La sintesi proteica è il processo che porta alla formazione di una nuova proteina, ossia una sequenza di amminoacidi denominata catena polipeptidica. Avviene in due fasi:

• Trascrizione: Avviene nel nucleo, dove l'mRNA possiede il gene del DNA trascritto, con l’informazione che passa da DNA a RNA.
• Traduzione: Avviene nei ribosomi del citoplasma, e viene tradotta l'informazione da sequenze di nucleotidi a sequenze di amminoacidi, che formeranno in seguito la proteina. Al processo servirà per forza il codice genetico, con l'informazione, indispensabile per la sintesi proteica, che passa dai geni alle proteine (Dogma Centrale della Biologia).

La trascrizione vede RNA-polimerasi sintetizzare il nuovo filamento di mRNA, che ha trascritto il messaggio dalla sequenza genica del filamento stampo di DNA, per uscire dai pori nucleari del nucleo, subendo il processo di splicing. Si assemblano nel citoplasma le due subunità del ribosoma, con la minore che si aggrega al tratto iniziale del mRNA e la maggiore che si attacca ad essa subito dopo. Nel punto di attacco dell’enzima RNA-polimerasi, i due filamenti del tratto di DNA corrispondenti ad un gene si aprono, con uno di essi che fa da stampo per la sintesi di una molecola di mRNA ad esso complementare. RNA-polimerasi si sposta lungo il filamento stampo di DNA aggiungendo nuovi ribonucleotidi ad estremità 3’ del nuovo filamento di mRNA, con direzione 5’-3’.