Appunti Applied entomology

UTILIZZO DI METODI MOLECOLARI PER L'IDENTIFICAZIONE DI TAXA

INTRODUZIONE ALLA TASSONOMIA MOLECOLARE

• Tassonomia: è il processo di nominare e classificare gli organismi in gruppi all'interno di un Sistema gerarchico, sulla base di similarità e differenze.
• Gruppo monofiletico: si intende un gruppo formato dall'antenato comune e tutti i componenti derivati.
• Gruppo parafiletico: si intende un gruppo formato dall'antenato comune ma con l'esclusione di uno dei componenti discendenti (es: crostacei).
• Gruppo polifiletico: si intende un gruppo al cui interno non vi è un antenato comune.
• Carolus Linnaeus (botanico Svedese), il padre dell'attuale Sistema di classificazione degli organismi e della nomenclatura binomia (Johan Christian Fabricius). Implicazioni in diversi campi, non solo scientifici.
• DNA: è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per...

lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.

DNA taxonomy: L'uso di una metodologia che usa il DNA per identificare gli organismi

DNA barcoding: un approccio standardizzato per identificare gli organismi utilizzando una sequenza di DNA chiamata DNA barcode (una piccola sequenza di DNA, presa da una regione riconosciuta come standard, e usata per identificare le specie).

Perché DNA taxonomy?

• Definire un metodo di riferimento e oggettivo per identificare gli organismi e risolvere i potenziali problemi legati agli "approcci tradizionali" che si basano sulla morfologia
• Identificazione degli organismi anche su campioni parziali o stadi di sviluppo, dove la morfologia sia poco informativa: provare a risolvere "l'impedimento della tassonomia"

APPROCCIO "TRADIZIONALE" NELLA TASSONOMIA ENTOMOLOGICA

Basata principalmente sulla morfologia esterna. ==> La specie è l'unica

Categoria linneana che la maggior parte dei sistematici (biologi in generale) riconosce come naturale. Una specie per evolvere deve includere individui che non si conformano completamente alla definizione.

Concetto biologico di specie (BSC): un insieme di popolazioni interfeconde in condizioni naturali e riproduttivamente isolate da altre analoghe (Mayr, 1942) ==> La specie intesa come una comunità riproduttiva: flusso genico tra individui e popolazioni (è il processo naturale che consente di identificare un’entità “reale”).

Instauratosi l’isolamento riproduttivo si determinerà divergenza fenetica. Ribaltamento della relazione causa-effetto ==> “due popolazioni sono morfologicamente simili perché appartengono alla stessa specie biologica”.

Quindi le differenze morfologiche costituiscono l’elemento di conoscenza attraverso cui inferire l’esistenza di un isolamento riproduttivo.

12- Concetto morfologico

di specie (fenetico, MSC): inteso come la versione operazionale del BSC. L'effettiva esistenza dell'isolamento riproduttivo deve essere dedotta da un'accurata analisi dei tratti morfologici. La tassonomia numerica (1960) riprende questo concetto, indicando con il termine di specie l'insieme di organismi sufficientemente distinti sul piano fenetico. Ogni concetto usa informazioni relative a caratteri per delineare i confini con le specie, e la maggior parte di queste informazioni è di tipo morfologico (Cracraft, 2000). Svantaggi: - È soggettivo, è lo specialista che decide - Problema della variabilità intraspecifica - Non univocità degli approcci analitici adottati - Specie criptiche: Differiscono sul piano genetico (?, altri?), non su quello morfologico (apparentemente!!) Concetto ecologico di specie: gruppo di organismi simili (o meno) fenotipicamente che occupano differenti nicchie ecologiche. Legato al BSC, implica unvantaggio selettivo per l'incrocio degli individui che occupano la stessa nicchia. L'integrità delle specie è mantenuta dalla selezione per l'adattamento a nicchie diverse, non dall'isolamento riproduttivo. Svantaggi: - Difficile adozione per le specie i cui semaforonti occupano nicchie ecologiche diverse - Definizione di nicchia ecologica non definita univocamente ==> iperspazio concettuale definito dagli nfattori biotici/abiotici che influenzano l'esistenza di un organismo/specie in un ecosistema In definitiva ha senso rispondere alla domanda "cos'è una specie?"... e cercare (se esiste) una definizione univoca? Una specie è considerata tale se è un tassonomo competente a deciderlo. (D. Raup). Attualmente, specie considerata come un "fenomeno diversificato" che può essere caratterizzato, morfologicamente, geneticamente, ecologicamente... piuttosto che definito nel suo.

complesso.^[2] APPROCIO “MOLECOLARE” NELLA TASSONOMIA ENTOMOLOGICA- La tassonomia molecolare unisce il BSC, MSC e anche il concetto filogenetico di specie. PSC considera i gruppi monofiletici come le uniche entità reali del processo evolutivo/speciazione: risultato di una analisi filogenetica- Breve storia: 1977: idea ==> 1996: primo studio sul DNA metabarcoding ==> 2003: uso del termine DNA barcoding ==> il presente ed il futuro: DNA barcoding, Metabarcoding, eDNA mteabarcoding- L’idea della tassonomia molecolare parte dal 1977 quando uno scienziato ha utilizzato delle sequenze 16s per identificare delle specie. Nel 1996 Giovannoni ha fatto dei lavori di metabarcoding sul batterio plancton. Nel 2003 vengono usate delle sequenze di C1, questo per capire se si potevano utilizzare dei “caratteri” per discriminare le varie tipologie di uccelli.^[3] AREE DI APPLICAZIONE- Applicazioni della DNA taxonomy:o Sicurezza alimentare e applicazioni mediche

veterinario Biomonitoraggio: DNA barcoding per identificare organismi da quarantena (programmi della protezione delle colture), e biomonitoraggio di insetti dannosi alle orticole Conservazione della biodiversità: ecosistemi marini, di acqua dolce e terrestri. Caratterizzazione della dieta.- DNA barcodes: sono regioni di marcatori genici, possibilmente corte, usate per l'identificazione tassonomica di organismi. Deve essere sufficientemente variabile da poter discriminare tra specie.13- DNA barcoding vs DNA metabarcoding (DNA target degradato): Caratteristiche dei primers1 Regioni di annealing molto conservate all'interno del gruppo2 Regioni di annealing non conservate all'esterno del Gruppo (uso dei blocking primers)Se stiamo confrontando un insieme di individui che fanno parte es. dell'adorifora e degli scoiattoli, la distanza interspecifica sarà logicamente enorme! Se invece prendiamo delle specie che stanno filogeneticamente vicini avremo pochissima

distanzainterspecifica.- Per identificare un organismo bisogna seguire questi punti:

1. Raccolta dei campioni
2. Estrazione DNA, solitamente si estrae solo da zampa, per ridurre la contaminazione di batteri. Qualche contaminazione nell'emolinfa c'è ma sono minori rispetto al corpo.
3. PCR
4. Sequenziamento Sanger
5. Controllo degli elettroferogrammi, contaminazioni (bisogna essere sicuri che non ci siano contaminazioni), numts (indica i geni che attualmente sono nel nucleo ma che sono di origine mitocondriale)
6. Comparazione con database di riferimento
7. Identificazione

Mutazioni del DNA possono essere sinonime o non sinonime. Quelle non sinonime fanno cambiare il codone e quindi mi ritrovo delle mutazioni sull'aminoacido.

L'evoluzione del DNA metabarcoding:

• DNA metabarcoding: È un metodo rapido per identificare simultaneamente gli organismi presenti in un campione (suolo, acqua) partendo dal DNA estratto da una comunità di organismi o eDNA. Combina due

tecnologie, ossia il DNA taxonomy e high-throughput DNA sequencing (HTS) platforms- eDNA: (environmental DNA) miscela di DNA genomico proveniente dai diversi organismi presenti nel campione ambientale. DNA estratto da campioni ambientali con lo scopo di ottenere l'informazione tassonomica e funzionale più comprensiva14o DNA intercellulare deriva da procarioti e/o eucarioti che vivono nei campioni ambientalio DNA extracellulare deriva dalle cellule di organismi morti (è degradato da agenti chimici e fisici)o Il problema del eDNA è che trova anche il DNA di specie magari non più presenti! Quindi il DNA extracellulare sarebbe da eliminare se si stanno cercando specie vive! In base agli obiettivi che ci poniamo dobbiamo cercare di utilizzare il DNA che più ci interessa.- Che tipo di marcatore genetico si usa? Dipende dagli scopi e dagli organismi target:o Batteri: 16S rRNAo Funghi: Internal transcribed spacer 1 and 2 (ITS1, ITS2) e altri specifici diciascun gruppo. Si possono amplificare entrambe o solo 1 delle 2. Piante: - ribulose-bisphosphate carboxylase (rbcL) - maturase K (matK) - psbA-trnH/ITS intergenic region Animali: - COX1 (geni mitocondriali del citocromo) - 18S rRNA - mitocondriale 12SrRNA/165 rRNA Metodo utilizzato in particolare quando non si sa bene cosa trovare, (oppure es: distinguere il gruppo di metazoi o la famiglia di nematodi pericolosi presenti nel campione) e permette di ottenere dei prodotti non troppo precisi. Per alcuni artropodi mt 12S rRNA e 16S rRNA Serve un database di sequenze di riferimento ben fatto, che deve essere sviluppato pian piano, è fondamentale un coinvolgimento tra i vari specialisti in modo da raccogliere più informazioni possibili. Sviluppo di un dataset: - Quanti organismi → minimo 3-5 individui per specie da diverse località dell'areale - Quale markers → facilmente disponibile nei campioni biologici, deve identificare

Id è un attributo utilizzato negli elementi HTML per identificare un elemento specifico. Ogni id deve essere unico all'interno di un documento HTML, il che significa che non può essere assegnato a più di un elemento.