Acidi Nucleici: struttura del DNA

Analoghi delle basi: Un'altra cosa in cui sono sfruttate le

forme tautomeriche delle basi azotate è la sintesi degli

analoghi come il Bromouracile: una struttura analoga

dell’uracile, ma la sua forma enolica è molto più

abbondante rispetto a quella dell’uracile stessa. In realtà

più che un analogo dell’uracile, lo è della timina perché

ha il bromo al posto del gruppo metilico, ma viene

chiamato bromouracile proprio perché è un uracile

sostituito con un bromo. Questa base può essere

incorporata nel DNA al posto della timina, ma visto che

ha un equilibrio diverso rispetto alla timina stessa può

avere un appaiamento diverso: mentre la timina si appaia con l’adenina, il bromouracile riesce a

formare legami a idrogeno stabili anche con la guanina, e questo fa

sì che il bromouracile risulti mutageno, ed ecco perché nella

replicazione può dare problemi. Può essere però usato per studiare

l’RNA, costruendo delle sonde a base di RNA; inoltre abbiamo alcuni

farmaci basati sulle strutture delle basi azotate, per esempio il

Fluorouracile è un farmaco antitumorale che inibisce la timidilato

sintasi; oppure la Mercaptopurina interferisce con la sintesi dei

ribonucleotidi purinici e di conseguenza con la sintesi del DNA.

Questi sono degli antitumorali perché sono farmaci non-targeted (non sono stati sviluppati

conoscendo in anticipo il target) e sono meno selettivi rispetto ad altri che invece hanno come

bersaglio altri composti all’interno della cellula che sono tipicamente over espressi in certi tipi di

tumori. In questo caso, la crescita incontrollata fa sì che questi abbiano comunque una certa

selettività, però sono tra i farmaci che possono causare perdita dei capelli o problemi alla pelle,

proprio perché sono quegli organi che tendono a riprodursi molto velocemente.

Struttura Secondaria del DNA

Abbiamo parlato dei legami a idrogeno e del fatto che questi sono importanti per la stabilità di

molte molecole organiche. Nel caso del DNA, sono tra i maggiori responsabili della stabilità della

doppia elica e quindi della formazione della struttura secondaria. L’appaiamento, nelle coppie di

Watson and Crick, forma legami a idrogeno stabili e questo spiega perché gli zuccheri dei

nucleotidi tendono a stare ad un certo angolo tra di loro dando origine alla formazione del solco

maggiore e del solco minore. Solco maggiore e solco minore sono importanti per il

riconoscimento da parte dei fattori di trascrizione della sequenza di un certo pattern di basi del

DNA. Queste molecole, avendo diversi gruppi funzionali, interagiscono tra loro come donatori ed

accettori di legami a idrogeno, ma possono interagire anche con altre molecole. Quindi il fatto che i

solchi abbiano una certa angolatura fa sì che le basi siano esposte alle altre molecole e quindi

riconoscibili.

La struttura del DNA è ormai nota. Tra i nomi da ricordare c’è quello di Chargaff, il quale dimostrò

che nel DNA il rapporto tra A e G e quello tra T e C varia, mentre quello fra A e T e fra G e C è

sempre molto prossimo a 1.

Questo lo portò ad ipotizzare che le basi si accoppiassero in questo modo: A-T e G-C. Questi però

non sono gli unici accoppiamenti possibili, infatti circa l’1% delle basi si associa diversamente

secondo un certo accoppiamento di Hoogsteen: un tipo di accoppiamento sin/anti invece che

anti/anti. Questo comporta che altri filamenti di oligonucleotidi possano interagire con una doppia

elica già esistente e formare delle interazioni. Questo può essere sfruttato per formare sonde per

riconoscere specificatamente determinate sequenze di DNA. Inoltre si trovano anche dei

superavvolgimenti i quali implicano accoppiamenti diversi: coppie di basi diverse e quindi

ripiegamenti diversi di oligonucleotidi con deviazione dall’idealità.

La doppia elica del DNA è stabilizzata principalmente da legami a idrogeno. Un ruolo importante

ce l’hanno le repulsioni tra i fosfati (per questo è importante che il gruppo fosfato sia acido e quindi

deprotonato); ma un altro ruolo importante è svolto dalle interazioni di stretching tra le basi azotate.

Le basi non sono perfettamente impilate l’una sull’altra, ma sono leggermente piegate e avvolte

lungo l’elica, ma comunque sia l’interazione tra le nuvole elettroniche è sufficiente per dare

stabilità.

Perché non abbiamo un’interazione forte tra le basi? Perché le interazioni biologiche devono

essere reversibili, quindi è un vantaggio che le interazioni tra le basi non siano forti, ed è per

questo che le interazioni non covalenti sono così importanti (essendo più deboli sono reversibili e

la loro forza è modulabile tramite il numero); poi nel caso della singola macromolecola, è

importante che questa resti flessibile e non sia completamente irrigidita: nel caso del DNA c’è

bisogno che la doppia elica si possa aprire. Questo fa sì che anche molecole diverse possano

interagire con il DNA andando, per esempio, a formare delle interazioni di stretching che possono

essere favorevoli e ulteriormente stabilizzanti per la molecola: questo è il caso degli agenti

intercalanti. Questi si vanno a posizionare tra le basi azotate formando delle interazioni di

stretching che stabilizzano l’elica. Su questo principio sono basati diversi farmaci antitumorali che

vanno a interferire con processi di srotolamento della doppia elica. La struttura chimica di queste

molecole è principalmente costituita da strutture policicliche planari e aromatiche. Possono essere

usati anche per visualizzare il DNA con esperimenti di biologia molecolare (si usa quindi il bromuro

di etidio); lo sviluppo di composti che possono essere usati come sonde o rivelatori per le molecole

biologiche è uno dei campi in cui la chimica biorganica trova applicazione, oltre allo sviluppo di

farmaci. Alcuni intercalanti vanno a bloccare l’elica, stabilizzandola ed impedendo il meccanismo di

srotolamento; altri apportano una modifica per cui la struttura non è più la stessa e questo causa

un cambiamento delle funzioni.

Strutture alternative del DNA:

HAIRPINS

Ci sono delle sequenze di DNA

che sono complementari nello

stesso filamento, per cui il

filamento tende a ripiegarsi e

formare una struttura a forcina.

Queste strutture si ritrovano spesso nei casi di alcune malattie neurodegenerative che implicano la

presenza di queste sequenze ripetute nel DNA che fanno sì che la struttura si ripieghi a formare

queste strutture a forcina. Chiaramente, questo va a competere con la formazione della doppia

elica e causa problemi. Un esempio di queste malattie è proprio la malattia di Huntington.

Compattamento del DNA in eucarioti

Il DNA deve essere compattato perché è una molecola

estremamente lunga che abbiamo bisogno di avvolgere e

ripiegare in modo che entri nel nucleo. Si ripiega tramite

strutture dette istoni che permettono al DNA di compattarsi

come un filo. Un ulteriore compattamento delle fibre di cromatina che si vengono a formare, fa sì

che il DNA si condensi di più dando origine ai cromosomi. Una cosa importante da ricordare è la

possibilità di avere modificazioni post traduzionali negli istoni: sono spesso delle modificazioni

transienti, che possono essere aggiunte e tolte, e che permettono alla cromatina di essere più o

meno avvolta (quando il DNA deve replicarsi non può restare avvolto sugli istoni). Queste

modificazioni specifiche sono metilazione o acetilazione molto spesso sulle lisine (AA con coda

basica amminica che permette queste modificazioni), o fosforilazioni su serina, treonina e tirosina.

Proprio la loro importanza strutturale e la presenza di modificazioni post-traduzionali ha fatto sì che

gli istoni siano diventati target per farmaci antitumorali, e sono inoltre molto studiati anche nella

ricerca biologica.

Biosintesi del DNA: DNA Polimerasi

Le DNA polimerasi sono state molto studiate sia per

capire come avviene la biosintesi del DNA, ma anche

per poterle sfruttare in laboratorio. Una di queste in

particolare, la Taq polymerase, è particolarmente

resistente alle alte temperature e viene quindi usata

nella PCR per replicare ed amplificare il DNA in

laboratorio. La sua scoperta è stata estremamente utile

per vari ambiti anche diversi dal laboratorio di ricerca,

come la genetica forense o la diagnostica.

Dobbiamo considerare il fatto che non tutti gli esseri hanno un genoma di DNA, alcuni virus hanno

un genoma di RNA e quindi noi abbiamo bisogno anche della trascrittasi inversa: enzima che

permette di sintetizzare il DNA a partire da RNA.

È stato scoperto, piuttosto recentemente, che la DNA polimerasi usa 3 ioni magnesio anziché 2.

Questo è importante per il meccanismo d’azione dell’enzima e ha importanza anche per la

concentrazione di magnesio che si utilizza quando si fanno gli esperimenti. Il terzo ione serve per

coordinare i fosfati: infatti aiuta a indebolirli per favorire l’attacco nucleofilo.

Sintesi chimica del DNA

Sappiamo che la biosintesi funziona con la polimerasi, ma dobbiamo pensare che per usare la

PCR abbiamo bisogno anche dei primer e di uno stampo da cui partire, quindi non possiamo

partire semplicemente dagli oligonucleotidi. L’utilizzo della PCR non si era ancora diffuso quando si

studiava la sintesi chimica del DNA, inoltre, fino agli inizi del 900, il codice genetico non era stato

ancora decodificato. La prima grande scoperta è stata l’identificazione di 50 codoni tramite la

sintesi enzimatica di oligonucleotidi di RNA, tradotti poi in peptidi che sono stati analizzati e

idrolizzati per identificare gli AA. Ancora oggi, per peptidi di media lunghezza, si può procedere in

questo modo per conoscere la composizione di AA all’interno del peptide: si idrolizzano con acidi

forti, si modificano per essere visibili all’UV e si analizzano con HPLC. Questo ha permesso di

identificare i primi 50 codoni.

È stato poi Khorana ad utilizzare i fosfati attivati per la sintesi dei primi oligonucleotidi, che

originariamente erano molto corti. Questo evento aprì la strada per la formazione di oligonucleotidi

più lunghi e lo studio del codice genetico.

Metodo Khorana: andando ad attivare il gruppo OH, si faceva un attacco sullo zucchero per poter,

ad esempio, fare una reazione di sostituzione. La DCC va ad attivare invece il fosfato, per cui

l’attacco è sul fosforo, si riesce così a formare il legame fosfodiestereo. Questo ha portato Khorana

a vincere il premio Nobel per la medicina nel 68.

Questa sintesi era limitata a pochi nucleotidi ed era molto laboriosa, nonché poco flessibile; infatti

la sintesi in soluzione ha bisogno di molti