Ingegneria genetica tesina

Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

A questo punto il complesso del DNAr deve entrare nella cellula

ospite e attraversare la membrana plasmatica.

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basta: l’ingegneria genetica

Il meccanismo si chiama trasformazione se il vettore è il plasmide

invece trasfezione se si tratta di un virus.

La cellula più utilizzata è l’Escherichia coli.

Clonazione e produzione del DNA ricombinante:

L’ espressione del DNAr, che coincide con la sostanza da produrre,

deve essere esaltata al massimo perché il processo consegua alte

rese: l’amplificazione dell’attività del DNAr si ottiene con la

clonazione e, quindi, con la riproduzione del ceppo mutato.

Quando il vettore utilizzato è il plasmide esso si riproduce

contemporaneamente alla cellula ma con ritmo più veloce.

Durante la coltivazione delle cellule possono verificarsi tre diverse

situazioni come:

La presenza del ceppo mutato contenente il gene-donatore

 La presenza del ceppo mutato contenente il plasmide originario

 La presenza del ceppo originario



Quindi è necessario separare questa miscela di organismi per

ricavare solo il ceppo mutato.

La tecnica utilizzata è la replica planting, che consiste nella

replicazione delle piastre mantenendo la stessa posizione delle

colonie della piastra di partenza, si procede nel pressare del velluto

liscio sul terreno da copiare in modo che il velluto “catturi” le colonie,

poi lo stesso velluto si pressa su delle piastre vergini che saranno

seminate mantenendo la posizione delle colonie della piastra

originaria. 15

Pag.

Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

Dopo la replica le colonie devono essere differenziate, la differenziazione

si basa sulle proprietà del plasmide.

Ad esempio il pBR322 nella sua struttura presenta la resistenza a due

antibiotici l’ampicillina e la tetraciclina, è stato osservato che l’enzima di

restrizione Bam HI taglia il gene della tetraciclina quindi si ha la

formazione dei seguenti ceppi:

Ceppo che contiene il pBR322 che al posto del gene della tetraciclina

 presenta il gene donatore

Ceppo con il plasmide pBR322 originario

 Ceppo originario

 16

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Per differenziare le colonie si eseguono semine su terreni contenenti gli

antibiotici, la prima semina si fa su un terreno contenente l’ampicillina, su

questo rimarranno solo i ceppi mutati, la seconda semina si fa su un

terreno contenente tetraciclina e ampicillina, su questo terreno rimarranno

solo i ceppi in possesso del plasmide originario, la posizione delle colonie

permette di identificarle ed isolare le colonie volute. 17

Pag.

Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

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basta: l’ingegneria genetica

Produzione e raccolta

Per ottimizzare la produzione:

La cellula ospite possa esprimere il gene estraneo

 L’ espressione deve essere la massima possibile

 La raccolta del prodotto deve essere relativamente semplice



Il microrganismo viene messo in bioreattori sterili dove vengono

controllate tutte le variabili possibili come PH, temperatura ecc. per

assicurare la massima produzione possibile in coltura discontinua e evitare

inquinamento e mutazioni genetiche.

La resa dell’impianto si attesta intorno al 20% ma attualmente è possibile

spingerla attorno al 50%, si deve tenere presente che la produzione della

proteina voluta invalida il metabolismo della cellula e che quindi si deve

trovare un compromesso tra la produzione e il metabolismo.

La posizione della proteina all’ interno della cellula può essere sia interna

e sia esterna alla cellula facendo sorgere diversi problemi, se la proteina è

localizzata nel citoplasma si trova complessata con le altre proteine

cellulari rendendo difficile l’estrazione, in questo caso si devono trovare

delle soluzioni di tipo biochimico tramite l’ uso di carrier che provvedono a

far fuoriuscire la proteina dalla cellula per poi estrarla in base a particolari

caratteristiche chimico-fisiche (filtrazione, elettroforesi, cromatografia).

Di seguito è riportata la procedura di separazione tramite l’uso dei carrier:

19

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Più semplice risulta l’estrazione all’ esterno della cellula, in questo caso un

enzima adatto provvede a separare ed attivare le funzioni della proteina.

Somatotropina (GH o HGH)

È un ormone polipeptidico che viene secreto dall’ ipofisi, regola

l’accrescimento di alcuni tessuti e in modo specifico delle ossa lunghe, una

sua eccedenza nel periodo dello sviluppo porta al gigantismo ipofisario

mentre una deficienza porta al nanismo ipofisario, invece nella fase

postpuberale un eccessiva produzione determina l’acromegalia

(deformazioni ossee e tissutali).

La composizione dell’ormone varia da specie a specie quindi questo

comporta difficoltà di estrazione, con altri ormoni invece si poteva

utilizzare un equivalente animale come con l’insulina che però poteva

portare a diversi problemi di allergia.

Attualmente la produzione avviene in parte per via biotecnologica con

batteri ingegnerizzati ed in parte viene sintetizzato chimicamente.

Struttura dell’ormone:

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Impianti:

Regolatori

Regolazione dei processi chimici

Per assicurare un buon funzionamento di un impianto sia chimico che

microbiologico (bioreattori) bisogna utilizzare un sistema di controllo e di

regolazione al fine di aumentare le rese e assicurare la sicurezza

dell’impianto.

importante tenere sotto controllo determinate variabili (temperatura, PH,

È

portata, livello, ecc.) e far sì che questa variabile sia praticamente uguale

al valore voluto (set-point).

L’ operazione di controllo prevede 3 fasi: 21

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Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

Misura della variabile che si vuole tenere sotto controllo o variabile

 controllata

Confronto della misura con il valore stabilito per essa

 Regolazione di una variabile detta variabile regolata, che serve per

 riportare il valore di set-point al limite stabilito

La variabile controllata e regolata possono essere uguali o diverse.

La maggior parte degli impianti di una certa importanza sono tenuti sotto

controllo tramite sistemi automatici in modo continuo.

Il sistema di controllo prevede 3 diversi apparecchi:

Un misuratore (sensore)

 Un controllore (regolatore)

 Un organo regolatore (attuatore)



La regolazione può essere di due tipi ad anello chiuso ed anello aperto.

Per capire le differenze tra regolatore ad anello chiuso ed aperto ci

serviamo di una schematizzazione dei due sistemi: Valore voluto

Controllore

Controllore

Sensore Attuatore Attuatore

Sensore

Disturbi Disturbi

Processo

Processo

Regolazione ad anello chiuso Regolazione ad

anello aperto

Il regolatore ad anello chiuso è più preciso ed accurato perché il

controllore agisce sull’ attuatore confrontando il valore del sensore con il

valore del set-point, invece quello ad anello aperto agisce sull’ attuatore

senza che vi sia alcun confronto con il sensore ed il valore di set-point

e può essere utilizzata solo quando non ci sono disturbi esterni al

processo, cosa che non avviene quasi mai.

Un esempio di regolazione ad anello chiuso è il seguente:

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basta: l’ingegneria genetica

In questo impianto si vuole neutralizzare una soluzione utilizzando una

soluzione neutralizzante con una vasca a perfetta miscelazione.

Un sensore legge il PH in uscita, un controllore che confronta il valore di

PH con il valore di set-point ed un attuatore costituito da una valvola

automatica.

Il controllore leggendo un valore diverso da quello di set-point comanda la

valvola che si apre/chiude e a seconda delle situazioni cerca di ridurre al

massimo le oscillazioni attorno al valore di set-point.

Le valvole automatiche ( ) possono essere di due tipi:

Valvola on/off con due modalità di funzionamento aperto/chiuso.

 Valvola pneumatica che possono essere regolate con estrema

 precisione

Trasduttori

Una volta effettuata la misura, il valore deve esser inviato al regolatore

che si trova ad una certa distanza dal sensore, il valore deve essere

convertito in grandezze facilmente trasmissibili come:

Intensità elettriche

 23

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Pressioni di un fluido all’ interno di un circuito (inadatto quando la

 distanza dal controllore è notevole)

L’ operazione si chiama trasduzione.

I trasduttori sono classificati a seconda dei segnali di ingresso e di uscita.

Regolatori

Una volta che il controllore ha effettuato il confronti, invia un segnale all’

attuatore in modo da evitare scostamenti intorno al set-point e che il

ripristino avvenga nel minor tempo possibile.

I regolatori possono essere discontinui che comportano un oscillazione del

valore intorno al set- point o continui che sono più accurati e possono

essere di tre tipi:

Ad azione proporzionale.

 Ad azione integrale.

 Ad azione derivativa



Regolatori ad azione proporzionale

Si basano su questa azione matematica:

Y=-k *x

p

Y=variazione trasmessa dal controllore all’ attuatore

K =costante del regolatore

p

X=scostamento tra il valore misurato e il valore di set-point

Il segno – è presente perché il regolatore deve agire nel senso della

chiusura se la grandezza aumenta e viceversa.

Un sistema proporzionale è efficace quando ci sono scostamenti

improvvisi e di breve durata della variabile controllata.

Il suo limite consiste che si deve agire manualmente nel caso ci siano

scostamenti permanenti della variabile controllata.

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Pag. Quando la natura non

basta: l’ingegneria genetica

Regolatori ad azione integrale

Si basano sulla seguente relazione matematica:

Y=-k ∫x*dt

i

Questo regolatore tiene conto non solo dello scostamento rispetto al

valore del set point ma anche per quanto tempo si perpetua.

La velocità dell’organo attuatore è tanto maggiore quanto maggiore è lo

scostamento della variabile controllata.

Il ripristino della normalità avviene in maniera oscillante come nel

seguente grafico:

Regolatori ad azione derivativa

Si basa sulla seguente azione matematica:

Y=-k *dx/dT

d

Questo regolatore tiene conto non tanto dello scostamento ma, ma dalla

velocità (data dalla derivata) con la quale si scosta dal set-point

graficamente rappresenta l’inclinazione della tangente della curva

rappresentativa: 25

Pag.

Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

I tre meccanismi di regolazione possono essere combinati tra di loro per

dare regolatori:

P.I

 P.D

 P.I.D



Regolatori P.I

Il regolatore ad azione proporzionale presenta il limite che la grandezza

controllata subisca scostamenti permanenti, ed abbiamo visto che il

regolatore ad azione integrale prevedono un ritorno al valore di set-point

in maniera oscillante.

Addizionando le due azioni è possibile superare questi due limiti ottenendo

un regolatore in grado di agire in modo adeguato, si basa sulla seguente

azione matematica:

Y=-k *x-k ∫x*dT

p i

Regolatori P.D

I regolatori ad azione derivativa hanno il limite di non riuscire a rilevare

scostamenti permanenti dal set-point, basandosi sulla velocità dello

scostamento:

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Pag. Quando la natura non

basta: l’ingegneria genetica

Però se c’ è uno scostamento diverso da 0 l’azione derivativa è il modo

migliore per ritornare al valore di set-point, per superare il suo limite viene

sempre accoppiato ad uno ad azione derivative, il miglioramento sta nella

prontezza della risposta.

La relazione matematica è la seguente:

Y=-k *x-k -dx/dT

p d

Regolatori P.I.D

Questi regolatori sono i più efficaci in quanto accoppiano tutte le possibili

azioni di regolazione con questa relazione matematica:

Y=-K *x-k ∫x*dT-k dx/dT

p i d

Simbologia UNICHIM

Per le funzioni di regolazione è un cerchio, nel cerchio ci sono le lettere

che indica la sua funzione, la prima lettera indica la grandezza, la seconda

la funzione ad esempio: 27

Pag.

Quando la natura non basta: l’ingegneria genetica

Le grandezze sono:

T=temperatura

 P=pressione

 L=livello

 F=flusso

 N=PH



Le funzioni sono:

I=indicatore

 C=controllore



Le linee di raccordo strumentali sono:

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