Elaborato maturità: ingegneria genetica, come isolare un gene

INGEGNERIA GENETICA

COME ISOLARE UN GENE

A partire dalla metà del secolo scorso, grazie a numerose scoperte relative al ruolo del DNA e degli enzimi, in

particolare a quelli di restrizione e alla trascrittasi inversa, si è sviluppata una nuova branca delle biotecnologie,

l’ingegneria genetica. Tale disciplina raccoglie in sé tutti gli studi e le sperimentazioni riguardanti le tecniche che

permettono di isolare, manipolare e clonare determinati geni e introdurli in un organismo differente, creando, in

questo modo, organismi ricombinati con caratteristiche diverse da quelli originari.

Per editing del genoma si intende, proprio l’insieme di 4. Si può ottenere il gene per sintesi chimica a partire

tecniche che danno la possibilità di modificare o sosti- dai singoli nucleotidi da cui è composto.

tuire piccole porzioni della sequenza del DNA degli or- Gli enzimi di restrizione

ganismi viventi senza spostarla dalla sua posizione na- Sono enzimi che riescono a tagliare il DNA in sequenze

turale nel genoma, per produrne uno più adatto a ri- più brevi e permettono di individuare il gene di inte-

spondere a specifiche esigenze. Queste procedure di resse. Sono generalmente prodotti dai batteri per di-

editing genomico, però, vennero sviluppate successi- fendersi dai batteriofagi poiché riescono a frammen-

vamente rispetto a quelle che sfruttano l’ingegneria tare il DNA virale prima che possa replicarsi all'interno

genetica, nelle quali, prima di agire con le eventuali della cellula, ma non riescono a tagliare il DNA batte-

modificazioni del genoma di un organismo, bisogna rico (protetto da metilazione). Queste “forbici” moleco-

identificare un gene per poi tagliarlo e isolarlo dalla lari riescono a scindere il legame tra il gruppo ossidrile

molecola del DNA, unire il gene ottenuto a un vettore dell'estremità 3’ e il gruppo fosfato nell’estremità 5’ del

e trasferirlo all’interno di una cellula ricevente. Negli ul- DNA ma solo se riconoscono specifiche sequenze, siti

timi decenni le ricerche più avanzate hanno condotto di restrizione, costituite da 4-6 nucleotidi spesso palin-

allo sviluppo di tecniche sempre più precise per pre- dromi.

parare, sintetizzare, analizzare e ibridare segmenti spe- Gli enzimi di restrizione si classificano, in base al taglio

cifici di DNA, e di metodiche sempre più maneggevoli che effettuano, in:

per trasferirli in siti specifici, clonarli, selezionarli otte-  Simmetrici: l’enzima taglia al centro della sequenza

nendone frammenti corrispondenti ai geni desiderati, e di restrizione producendo sequenze complemen-

associarli fino a ottenere cromosomi artificiali. tari della stessa lunghezza;

COME ISOLARE UN GENE  Asimmetrici: il taglio viene fatto sfalsato o obliquo

Il gene di interesse può essere isolato in diversi modi, generando filamenti con l'estremità 5’ più lunghi

in generale le tecniche utilizzate sono quattro: rispetto a quella 3’ o viceversa. L'estremità a sin-

1. Si può estrarre il gene direttamente dalle cellule golo filamento che vengono prodotte sono dette

per mezzo di enzimi di restrizione: si otterranno in coesive in quanto suscettibili di perfetto accoppia-

questo modo frammenti di DNA clonati che for- mento con sequenze di basi complementari favo-

mano le cosiddette librerie geniche a cui attingere rendo, così, la ricombinazione dei frammenti di

per ottenere i geni da trasferire in un altro organi- DNA.

smo. Questo metodo, però, richiede molto tempo Esistono alcuni enzimi di restrizione che riconoscono

e risorse; siti diversi ma lasciano estremi compatibili e sono detti

2. Si può sintetizzare il gene a partire dallo specifico isocaudameri.

mRNA ricavato da cellule che lo posseggono gra- Per la ricombinazione dei frammenti di DNA è neces-

zie all’utilizzo della trascrittasi inversa; sario ricreare i legami fosfodiesterici tra nucleotidi adia-

3. Si può sfruttare le reazioni a catena della polime- centi per mano di particolari enzimi chiamati ligasi che

rasi PCR in cui si parte direttamente dal DNA; richiedono ATP e specifiche temperature.

INGEGNERIA GENETICA

L’ELETTROFORESI & SONDE MOLECOLARI

L’ELETTROFORESI SU GEL DI FRAMMENTI DEL DNA

Quando si tratta il DNA con enzimi di restrizione si produce una miscela di frammenti di lunghezza diversa. Per

separarli si utilizza l’elettroforesi su gel che sfrutta le differenze dimensionali e fisico-chimiche dei frammenti di DNA,

molecola carica elettricamente e di conseguenza ha la capacità di migrare all'interno di un campo elettrico.

Tale tecnica prevede l'utilizzo di una matrice di separazione, solitamente gel d'agarosio che funge da rete in quanto

i frammenti di DNA durante la migrazione si separano in base alla loro lunghezza o al peso molecolare. La porosità

dell’agarosio dipende dalla sua concentrazione, ma generalmente lo si utilizza al 0,8-2 % che permette di differen-

ziare frammenti che vanno dai 200/500 bp alle 20kbp (per separare molecole più piccole è necessario ricorrere al

gel di poliacrilammide). La matrice deve essere disciolta in un tampone di corsa (soluzione salina che serve a mante-

nere costante il pH e la ionizzazione delle molecole da separare) con il quale è saturato il supporto per consentire il

passaggio della corrente continua. L'agarosio sciolto nel tampone è depositato e fatto solidificare in un supporto in

cui sono creati diversi pozzetti allineati in cui successivamente saranno depositati i campioni. A questo punto, il gel

completamente sommerso dal tampone è sottoposto a un campo elettrico costante per 20-30 minuti. A fine corsa

i frammenti di DNA possono essere osservati solo dopo colorazione con coloranti fluorescenti.

LOCALIZZARE UN GENE TRAMITE SONDE MOLECOLARI

L'individualizzazione del gene di interesse si realizza impiegando sonde che sfruttano la caratteristica della com-

plementarietà delle singole basi azotate per cui le sequenze spaiate hanno una naturale tendenza ad accoppiarsi

con quelle complementari. lavaggi si procede alla rivelazione dell’ibrido tar-

Le sonde molecolari get/sonda. Tra le tecniche di ricerca diretta di se-

Per la ricerca del gene target è possibile ricorrere quenze polinucleotidiche abbiamo:

all'uso di sonde molecolari a DNA o RNA (probes). Sono  Southern blotting in cui il campione di DNA è dige-

frammenti specifici marcati radioattivamente o con rito con enzimi di restrizione, i frammenti ottenuti

fluorocromi che possono ibridare. Affinché avvenga l'i- sono separati mediante elettroforesi e successi-

bridazione sia la sonda che l'acido nucleico devono vamente sono denaturati con soluzioni alcaline,

trovarsi in forma di singoli filamenti per cui devono ini- neutralizzati e trasferiti su nitrocellulosa e fissati. Il

zialmente essere denaturati e miscelati. Le sonde pos- filtro è infine esposto all'azione di una sonda. Que-

sono essere sintetizzate mediante clonazione del DNA sta tecnica consente di identificare e analizzare i

in vettori molecolari; attraverso l’uso della trascrittasi in- polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restri-

versa formando cDNA; attraverso la PCR; oppure per zione e di analizzare la presenza di specifiche mu-

sintesi chimica partendo da nucleotidi trifosfati modifi- tazioni, il loro rapporto con una malattia genetica

cati. e il numero di copie di un gene nel genoma;

La scelta del marcatore dipende dal tipo di risoluzione  Northen blotting molto simile a quella precedente

desiderata, dalla sensibilità, dalla stabilità nel tempo e ma sul filtro è trasferito il RNA anziché il DNA e la

dai rischi connessi alla sua manipolazione. Le sonde in sonda può essere sia a DNA che a RNA;

base a questo criterio possono essere:  Dot-blot il DNA o l’RNA sono posti direttamente

 32 35

Calde: sono formate da isotopi radioattivi ( P, S) sul filtro che poi è ibridato con una sonda. Questa

e sono molto sensibili. La rivelazione prevede l'uso tecnica è utilizzata in diagnostica microbiologica

di lastre autoradiografiche; per la ricerca di microrganismi patogeni. È un test

 Fredde: sono più stabili e di uso meno problema- utile per selezionare le cellule trasformate ricom-

tico si ottengono marcando i nucleotidi con: binanti da quelle non ricombinanti.

fluorocromi (fluorosceina) prevede una rivela-

o IN SITU

zione diretta; Questa procedura è usata per verificare la presenza o

biotina (vitamina) prevede una rivelazione indi-

o meno di una sequenza e per identificare sul quale cro-

retta con tecniche immunoenzimatiche o con mosoma o in quale posizione è posizionato un gene.

anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi; Può avere come target:

digossigenina (steroide).

o  RNA citoplasmatico: su un vetrino vengono poste

Tecniche di ibridazione cellule permeabilizzate in modo da permettere

Sono numerose le tecniche utilizzate a questo scopo l'ingresso della sonda. Questo metodo è abbinato

ma in generale si possono dividere in due grosse cate- spesso a colture cellulari che permettono di mo-

gorie: su filtro e in situ. strare come determinate molecole modificano

SU FILTRO l'espressione dati di geni;

L’ibridazione avviene fra la sonda in soluzione e un ac.  DNA cromosomico: consente di localizzare diretta-

nucleico immobilizzato su filtro di nylon o di nitrocellu- mente un gene sui cromosomi in metafase, in

losa. Essa prevede il trasferimento su filtro degli ac. nu- questo caso il risultato non è la presenza di un

cleici bersaglio denaturati, il loro fissaggio sul supporto gene ma la specifica porzione cromosomica. È

mediante calore o raggi UV, successivamente una pre- condotta quando si sospetta che sia avvenuta una

ibridazione con un tampone. A questo punto si pro- traslocazione cromosomica (es. tumori o malattie

cede all’ibridazione vera e propria con il tampone e la genetiche).

sonda marcata e denaturata, infine, dopo una serie di INGEGNERIA GENETICA

VETTORI MOLECOLARI

INSERIRE GENI NELLE CELLULE: I VETTORI MOLECOLARI

L'introduzione di molecole di DNA esogeno si chiama trasformazione se avviene in una cellula ospite batterica o

trasfezione quando riguarda le cellule eucariotiche. Questo processo avviene tramite l'uso di vettori molecolari, ele-

menti genetici extracromosomici che possono contenere e trasportare un frammento di DNA, inserto, e mantenerlo

stabile nella cellula ospite. Tutti i vettori devono rispettare una serie di requisiti affinché possano essere usati, i più

importanti sono: un unico punto;

 La facilità nel penetrare nella cellula ospite; 

 la presenza di geni marcatori selezionabili che

La stabilità e la compatibilità con la cellula ospite; permettono l'identificazione e l'isolamento delle

 la capacità di replicarsi in modo autonomo; cellule ricombinanti.

 la presenza di siti di restrizione unici per ogni en-

zima di restrizione in modo che il vettore si tagli in

I vettori possono essere di varia natura ma i maggiormente diffusi sono i plasmidi (vettori batterici), i virus e i loro

derivati ingegnerizzati. cresceranno soltanto le colonie con il plasmide ma non

I Plasmidi ricombinante. Dunque le colonie che devono essere

Sono molecole circolari di DNA extracromosomico do- prese in considerazione saranno quelle cresciute nella

tati di replicazione autonoma. Non sono indispensabili seconda piastra ma non nella terza. Questa tecnica

però conferiscono ai batteri che li possiedono caratte- viene chiamata replica plating.

ristiche fenotipiche particolari. Alcuni vettori di clonaggio sono stati costruiti per velo-

Sono i vettori più utilizzati per le loro piccole dimensioni cizzare e facilitare lo screening dei cloni ricombinanti

e per la loro facilità di trasferimento di geni ma hanno il utilizzando diversi marcatori di selezione e sfruttando il

limite di non poter ospitare frammenti di DNA esogeno fenomeno di inattivazione inserzionale chiamato α-

non più grandi di 10 000 nucleotidi. complementazione. Fanno parte di questo gruppo i

Al fine di poter funzionare come vettori, i plasmidi, de- pUC (plasmidi relativamente piccoli presenti nella cel-