Cellule o.g.m

INDICE

MAPPA CONCETTUALE

 INTRODUZIONE



Capitolo 1 LA NASCITA DI UN’IDEA

LE MUTAZIONI E LA MUTAGENESI ARTIFICIALE

• DAL DNA ALL’INGEGNERIA GENETICA

•

Capitolo 2 COME LE CELLULE CAMBIANO

STORIA DELLA TRASFEZIONE

• COME FUNZIONA

•

Capitolo 3 IN PRATICA …

CELLULE HeLa E UBIQUITINA

• IL PROTOCOLLO

• I RISULTATI

•

Capitolo 4 O.G.M. E PROBLEMI

UNA DEFINIZIONE

• BENEFICI E RISCHI

• BREVETTARE I GENI?

•

BILIOGRAFIA

 SITOGRAFIA

 3

MAPPA CONCETTUALE

LA SCOPRETA DELLE MUTAZIONI E DELLA VIENE DEFINITO IL CONCETTO DI

MUTAGENESI ARTIFICIALE MUTAZIONE E SI INZIANO A TROVARE

MODI PER SFRUTTARE IL FENOMENO

MA COME SI CONTROLLA E QUALI

SONO LE CAUSE?

LA SCOPERTA DEL DNA E DELLA SUA GRAZIE A QUESTA SCOPERTA SI INZIA A

STRUTTURA CAPIRE IL MECCANISMO CHE REGOLA

L’ESPRASSIONE DEI GENI E I LORO

CAMBIAMENTI

CON LE TECNICHE DEL DNA RICOMBINANTE SI

NASCE L’INGEGNERIA GENETICA POSSONO CREARE NUOVI GENI O MODIFICARE

QUELLI ESISTENTI

I GENI MODIFICATI DEVONO ESSERE

COME PRODURRE GLI O.G.M. ’

INTRODOTTI NELLE CELLULE, QUESTO PUO

AVVENIRE IN VARI MODI, COME LA

TRASFEZIONE PER LIPOSOMI

LA TRASFEZIONE NELLE CELLULE

HeLa LE CELLULE VENGONO MODIFICATE PER

’

PRODURRE UNA QUANTITA DOPPIA DI

UBIQUITINA, L’ESPERIMENTO SERVE PER

DETERMINARE LA CORRISPONDENZA TRA

QUESTA MUTAZIONE E L’INSORGENZA DI

I PROBLEMI e I BENEFICI TUMORI

LA DIFFUSIONE DEGLI O.G.M. POTREBBE

PORTARE A GRAVI CONSEGUENZE SUL PIANO

AMBIENTALE E PER LA SALUTE. UN ALTRO

’

BIBATTITO SI E APERTO ANCHE SULLA

’

QUESTIONE DEI BREVETTI, E GIUSTO

BERVETTARE I GENI?

4

INTRODUZIONE

L’argomento di questa tesina riguarda il percorso compiuto dalle biotecnologie per giungere alla

creazione degli O.G.M., dalla definizione del concetto di mutazione agli inizi del ‘900, fino alla

scoperta delle tecniche che ne permettono il controllo e l’applicazione.

Grazie a uno stage compiuto questa estate presso i laboratori di ricerca del centro di oncologia

molecolare IFOM ho avuto l’opportunità di osservare in prima persona un metodo per la

produzione di organismi geneticamente modificati all’interno della ricerca sui tumori e le loro

cause.

Oltre ai loro utilizzi terapeutici, come in questo caso, gli O.G.M. possiedono moltissime altre

potenzialità in molti ambiti, che tuttavia devono essere ancora correttamente valutate in

rapporto all’effettiva e ai loro potenziali rischi per l’uomo e per l’ambiente.

Un aspetto del complesso dibattito è la polemica riguardante il problema dei brevetti, che oltre

a sollevare molti dubbi etici, mette in evidenza come spesso la legislazione in questo settore sia

più volta a favorire le grandi aziende multinazionali che il giusto utilizzo di queste tecnologie.

5

LA NASCITA DI UN’ IDEA

LE MUTAZIONI e LA MUTAGENESI ARTIFICALE

• Il termine mutazione in campo genetico venne introdotto la prima volta nel 1901 da Hugo de Vries,

il quale, in seguito ai suoi studi sulla rapunzia europea, aveva notato come dei nuovi caratteri, non

presenti nei genitori, comparissero all’improvviso nelle

generazioni successive. De Vries ricondusse la

comparsa di questi nuovi caratteri a improvvisi

cambiamenti avvenuti all’interno dei geni e ipotizzò

anche che tali modifiche potessero essere ereditarie.

Sempre nei primi anni del novecento Thomas Hunt

Morgan e il suo Drosophila Group compirono il primo

sfruttamento consapevole di mutazioni naturali con lo

scopo di dimostrare il legame tra geni e cromosomi

all’interno dei moscerini della frutta. Grazie a questi

esperimenti Morgan riuscì a verificare la

F 1 RAPUNZIA EUROPEA

IGURA corrispondenza tra il colore bianco degli occhi e il

cromosoma X, dimostrando come questa mutazione

fosse più frequente nei maschi, compiendo esperimenti simili a quelli di Mendel con le piante di

pisello.

Tuttavia le possibilità di raccogliere dati come quelli di Morgan erano molto scarse vista la scarsa

frequenza delle mutazioni naturali e la loro difficile individuazione, quindi tra gli scienziati si iniziò a

far strada l’idea di provocare artificialmente mutazioni all’interno degli organismi in modo da

poterne studiare gli effetti e avere una maggiore quantità di casi osservabili. Nel 1927 Muller, un

membro del Drosophila Group, arrivò alla conclusione che i raggi X in dosi massicce fossero in

grado di provocare mutazioni indotte nelle cellule e che tali mutazioni fossero della stessa natura di

quelle spontanee. Le sue tesi furono confermate da diversi esperimenti sulle cellule animali sia

vegetali e portarono, all’inizio della seconda guerra mondiale, alla scoperta di altri agenti mutageni

chimici, come il gas di mostarda.

Grazie alla mutagenesi artificiale vennero condotti gli esperimenti che portarono alla formulazione

del famoso dogma un gene- una proteina e alla scoperta della coniugazione batterica.

6

DAL DNA ALL’INGEGNERIA GENETICA

• Tuttavia l’uso dei raggi X o di altri agenti mutageni non consentiva di controllare i processi di

mutazione o le loro conseguenze, per riuscire a farlo

bisognava comprendere la struttura molecolare dei geni e

il loro funzionamento. Nel 1953 Watson e Crick

costruirono un modello di DNA a doppia elica, rendendo

così possibile spiegare i meccanismi di duplicazione e di

funzionamento del materiale genetico. Grazie a questa

scoperta si posero le basi dell’ingegneria genetica, che

consiste nel trasferire materiale ereditario da un

organismo a un altro.

Edward Tatum suddivise l’ingegneria genetica in tre

categorie: Eugenetica, cioè la ricombinazione di geni

esistenti, Ingegneria genetica, cioè la produzione di nuovi

geni, e Ingegneria eufenica, cioè la modificazione o il

controllo dell’espressione dei geni.

Negli anni ’60 venne messa a punto una delle tecniche

più importanti per la manipolazione del materiale F 2 WATSON E CRICK

IGURA

genetico: il DNA ricombinante. La tecnica del DNA

ricombinante sfrutta la capacità degli enzimi di

restrizione,

presenti nei

batteri, di tagliare il DNA in punti precisi, in modo da

creare segmenti che possono essere ricombinati e

successivamente introdotti nelle cellule.

Grazie a questo metodo nel 1973 venne prodotto il primo

O.G.M. moderno da Stanley Cohen E Herbert Boyer, che

inserirono all’interno di un batterio Escherichia coli un

gene clonato di rana.

Da allora sono stati creati molti prodotti ad uso

commerciale derivati da O.G.M come l’insulina

ricombinate, la somatostatina e diversi tipi di sementi,

F 3 COLONIA DI E

IGURA SCHERICHIA COLI modificati per resistere al gelo e ai pesticidi.

7

COME LE CELLULE CAMBIANO

LA STORIA DELLA TRASFEZIONE

• I geni, una volta modificati, devono essere inseriti nelle cellule in modo da poter essere espressi.

I metodi più usati all’inizio furono l’uso della trasformazione batterica o di vettori virali.

La trasformazione sfrutta la capacità dei batteri di acquisire il DNA di altre cellule batteriche lisate

attraverso la membrana cellulare, mentre i vettori virali consistono nell’infezione delle cellule da

parte di virus contenenti il DNA da inserire. Queste tecniche tuttavia risultano molto imprecise e

soprattutto l’uso dei virus può risultare difficile da controllare o pericoloso, visto il loro potere

patogeno. D’altra parte, l’introduzione di DNA nelle cellule senza l’utilizzo di vettori appare

impossibile visto che sia la membrana che il DNA stesso sono carichi negativamente.

Negli anni ’70 vennero quindi messi a punto dei metodi per rendere il materiale genetico neutro

grazie a sostanze chimiche e nel 1978 Graham e Van der Eb descrissero per la prima volta

l’inserimento di geni in una cellula grazie a una soluzione di fosfato di calcio.

COME FUNZIONA

• La trasfezione è un processo che permette

di inserire artificialmente

e in modo stabile nei cromosomi una

sequenza di DNA estranea. Questo processo

può avvenire con la mediazione di soluzioni

di fosfato di calcio, per elettroporazione,

si praticano aperture nella membrana

cellulare grazie a scariche elettriche da cui il

DNA entra, o con i liposomi.

Uno dei metodi più efficaci e sicuri è quello

che utilizza i liposomi. I liposomi sono

piccole membrane lipidiche che incapsulano

il costrutto e, grazie alla loro struttura simile

alla membrana, possono essere facilmente

inglobate per endocitosi. I geni estranei

possono quindi integrarsi con quelli del

nucleo consentendo di ottenere una

popolazione di cellule modificate. 8

IN PRATICA …

CELLULE HeLa e UBIQUITINA

• L’ubiquitina è una proteina prodotta da tutte le cellule eucariote. La sua funzione principale è

quella di segnalare la presenza di proteine inutili in modo che possano essere riconosciute dal

sistema di distruzione della cellula, legandosi ad esse. Sfruttando il suo ruolo di marcatore, svolge

inoltre altri compiti importanti, come la direzione del trasporto delle molecole dentro e fuori la

cellula.

A causa delle sue funzioni molto complesse una possibile anomalia nella produzione normale di

ubiquitina potrebbe generare modifiche pericolose all’interno della cellula. Per capirne le

conseguenze occorre creare una linea cellulare stabile con una sovrapproduzione della proteina.

Le cellule usate per l’esperimento sono cellule HeLa, cioè cellule provenienti dall’adenocarcinoma

della cervice uterina, di cui si conoscono molto bene le caratteristiche.

Queste cellule vengono modificate in modo che possano

produrre una quantità doppia di proteina, grazie

all’inserimento nel loro nucleo di un costrutto, chiamato

Flag- HIS-Ub, contenente il gene per la sintesi

dell’ubiquitina.

F 5 CELLULE H L

IGURA E A

IL PROTOCOLLO

• Il costrutto Flag- HIS-Ub viene fatto entrare nelle cellule secondo la procedura:

- In una provetta unire 3 μl di DNA (0.33 γ/ μl) all’Optimem fino a ottenere 100 μl di

soluzione

- In una seconda provetta mettere 6 μl di Lipofectamine, la soluzione contenente i liposomi,

e l’Optimem sempre fino a 100 μl di volume, lasciare 5 min a temperatura ambiente

- Unire goccia-goccia la seconda soluzione alla prima e lasciare per 20 min a temperatura

ambiente, per fare in modo che il DNA venga correttamente incapsulato

- Preparare le piastre a pozzetti con le cellule togliendo il terreno e mettendo 800 μl di

Optimem per ognuno

- Aggiungere 200 μl di soluzione di DNA più il Lipofectamine in ogni pozzetto e lasciare per

4h

Dopo quattro ore la trasfezione dovrebbe essere avvenuta e, qualche giorno più tardi, si possono

verificare i risultati al microscopio. 9

I RISULTATI

• Le cellule modificate vengono colorate grazie a particolari anticorpi che si legano solo all’ubiquitina

presente nel citoplasma e al nucleo con un procedimento chiamato immunofluorescenza.

In questo modo si possono distinguere da quelle

rimaste normali, in caso di trasfezione non riuscita,

e confrontare con i campioni negativi.

Infatti, i campioni positivi appaiono rossi, mentre in

quelli negativi si vedono solo i nuclei delle cellule

colorati di blu.

Le cellule trasfettate vengono in seguito coltivate e

usate per altri esperimenti. F 6 CELLULE NEGATIVE

IGURA

F 7 CELLULE POSITIVE

IGURA 10

O.G.M. e PROBLEMI

UNA DEFINIZIONE

• Le cellule che si ottengono con questi processi sono a tutti gli effetti degli O.G.M.

Con questa definizione si intendono degli organismi il cui patrimonio genetico è stato manipolato

attraverso le tecniche dell’ingegneria genetica e che, oltre alle singole cellule, come in questo caso,

possono essere applicate anche ad altri organismi più complessi.

In questo modo si possono ottenere piante o animali con caratteristiche completamente diverse da

quelle di partenza, oppure velocizzando notevolmente i risultati ottenibili precedentemente con i

tradizionali incroci.

BENEFICI e RISCHI

• Oggi gli organismi geneticamente modificati vengono prodotti e studiati principalmente in campo

medico-farmacologico e in campo agroalimentare.

Lo scopo è quello di ottenere piante o animali più adatti alle esigenze umane come, ad esempio,

batteri capaci di sintetizzare farmaci, piante più resistenti e produttive o animali d’allevamento con

ritmi di accrescimento più veloci. Grazie a queste caratteristiche e ai loro vantaggi commerciali, gli