Biochimismo manipolato dei batteri tesina

Il Biochimismo

Manipolato

dei Batteri.

Caratteri Generali,

Il Genoma Batterico,

Mutazioni Batteriche,

Effetti delle Mutazioni,

Agenti mutageni,

Scambi Genici e Ricombinazione Genetica,

DNA Sintetico,

PCR (Polymerase Chain Reaction),

Ricadute Pratiche della Tecnica PCR,

Le Applicazioni del rDNA.

Caratteri Generali

Gli elementi essenziali della genetica delle cellule

eucariotiche e procariotiche sono:

• la struttura biochimica del DNA,

• duplicazione del DNA,

• codice genetico,

• sintesi dell’RNA,

• sintesi delle proteine.

Il Genoma Batterico

Il genoma è l’insieme dei geni di un organismo, in questo caso,

l’insieme dei geni di un batterio. Il genoma è organizzato su di

un solo cromosoma ad anello.

Il numero di geni si calcola nell’ordine di 3500 – 5000.

L’identificazione di un gene in termini di ubicazione sul

cromosoma e espressione proteica

prende il nome di “mappatura”.

La mappatura più completa che si ha riguarda Escherichia Coli.

Mutazioni Batteriche

Con questo termine si indica la variazione del codice genetico rispetto a quello

originario.

Si distinguono in:

Mutazioni Casuali: non intervengono su un gene in particolare e si dividono in:

• Spontanee: legate alla possibilità di errore correlata alla frequenza riproduttiva.

• Indotte: legate a Raggi X, UV e agenti chimici.

Mutazioni da biochimismo manipolato: intervengono su un gene specifico.

La mutazione che riguarda un singolo gene prende il nome di mutazione genica.

Può essere dovuto a: 1)Microlesioni, si dividono in:

• transizione: variazione

• inserzione: inserimento o dell’orientamento di una coppia di

perdita di basi puriniche con una di basi

una coppia di basi azotate. pirimidiniche (es. C-G con G-C, …), o

relativa sostituzione.

2) Macrolesioni, si dividono in:

۰ delezione: perdita di ۰ duplicazione:

ripetizione di

un segmento di DNA. un segmento di DNA.

۰ Inversione: rotazione di 180˚ di ۰ inserzione:

inserimento di un nuovo

un segmento di DNA. segmento di DNA.

Effetti delle mutazioni.

Le mutazioni si classificano in:

1) Silenti : non hanno espressione fenotipica, perché la proteina che ne è

influenzata non è rilevante nel metabolismo dell’organismo o perché

la proteina modificata è simile a quella originaria.

2) Mutazioni per i fattori di crescita : determinano organismi auxotrofi, cioè

non più in grado di sintetizzare una determinata molecola indispensabile per

la propria sopravvivenza, e che quindi dovranno ricevere tale sostanza nel

terreno di coltura.

3) Mutazioni letali condizionali : determinano la formazione di proteine

alterate che funzionano solo in particolari condizioni.

4) Mutazioni pleiotropiche : variano più caratteri nello stesso tempo.

5) Mutazioni strutturali : cambia fisicamente la forma del microrganismo.

Effetti delle mutazioni.

1) Analoghi di base : si inseriscono nella catena sostituendo o la timina o

l’adenina modificando in questo modo il codice genetico.

2) Prodotti alchilanti : sono in grado di fare appaiare la guanina con la timina.

(arancio di acridina e proflavina

3) Colori di acridina ): si inseriscono fra le basi

azotate distorcendo la struttura del DNA.

4) Radiazioni ionizzanti e UV, carcinogeni : fanno legare covalentemente due

molecole di timina adiacenti, determinando la distorsione

dell’elica per rottura dei legami fra timina e adenina.

Scambi Genici e Ricombinazione Genetica.

Lo scambio dei geni è una possibilità che possiedono quasi tutti gli esseri

viventi, ad esempio attraverso la riproduzione asessuata, a partire dal

crossing over prima della divisione cellulare e poi con la riproduzione per

meiosi, perché così si assicura ad ogni generazione quella variabilità

intraspecifica che è alla base del modello evolutivo darwiniano.

I batteri hanno possibilità molto ridotta, tuttavia essa viene lo stesso esercitata

attraverso le seguenti modalità:

1)Trasformazione : alcuni batteri riescono ad assorbire frammenti di DNA di cellule

che lo hanno perso ad esempio per lisi batterica, attraverso la membrana

cellulare.

2) Coniugazione : attraverso lo scambio di plasmidi.

3) Trasduzione : consiste nel passaggio del DNA di un batterio ad un altro tramite

un fago.

Il DNA Ricombinante (rDNA).

Con la tecnica del DNA ricombinante è possibile, individuato un gene

significativo per il genoma umano e la cui proteina corrispondente è di

grande importanza in campo ad esempio sanitario, inserirlo in un

microrganismo attraverso le seguenti fasi:

1) Individuazione del gene di interesse nel genoma umano

2) Purificazione del DNA genico

3) Fusione del DNA genico con DNA di trasporto

4) Inserimento dell’rDNA nel microrganismo

5) Coltivazione del microrganismo e conseguente utilizzazione del

Lo strumento attraverso il quale

tutto ciò è possibile è

rappresentato dagli enzimi di

restrizione.

Gli enzimi di restrizione vengono

utilizzati sia per separare il gene

dal genoma della cellula

eucariote, sia per interrompere il

plasmide che sarà usato come

vettore di clonaggio e al cui

interno sarà inserito il nuovo

gene. Il plasmide vettore di

clonaggio sarà poi appunto il

vettore del nuovo gene in un

batterio ospite, all’interno del

quale si esprimerà il nuovo

fenotipo.

Il DNA Sintetico.

Attraverso la tecnica del DNA ricombinante è possibile anche realizzare

del DNA sintetico, manipolando segmenti di oligonucleotidi. Questi

segmenti possono successivamente essere inseriti in un batterio

utilizzando un vettore di clonazione (plasmide) con la tecnica già

descritta descrivendo l’rDNA, osservando così la mutazione indotta.

PCR ( Chain Reaction)

Polymerase

“Reazione a catena della polimerasi”

Si tratta della tecnica di biologia molecolare che consente di ottenere

copie in grandi quantità dello stesso segmento di DNA senza l’utilizzo di

organismi viventi del quale si conoscano le sequenze nucleotidiche

iniziali e terminali.

Praticamente consente di ottenere in vitro molto rapidamente la

quantità di materiale genetico necessario per successive applicazioni.

Le tappe che consentono lo svolgimento della PCR sono le seguenti:

1) Devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto forma di

desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP);

2) Il DNA deve essere denaturato, ovvero le due eliche che

compongono i filamenti

devono essere già separate;

3) Il segmento da ricostruire può essere soltanto prolungato, ovvero

non è possibile sintetizzare un nuovo filamento a partire da zero;

4) Devono, inoltre, essere rispettate opportune condizioni di

temperatura, pH, ecc.