Valutazione della caratterizzazione di tumori polmonari tramite metodica fish

Valutazione della caratterizzazione di tumori polmonari tramite metodica FISH

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”

Dipartimento di Medicina Molecolare

Laurea Triennale in Scienze Biologiche

Valutazione della caratterizzazione di tumori polmonari tramite metodica FISH

Relatore: Prof.ssa Paola Perucca

Correlatore: Dott.ssa Gabriella Gaudioso

Tesi di Leonardo Minestra

Anno Accademico 2019/2020

Introduzione

Il tumore al polmone è la causa principale di morte nei paesi industrializzati, dovuto non solo a fattori genetici, ma anche ambientali. Il fumo di tabacco costituisce il più importante fattore di rischio per l’insorgenza dell’85% dei casi di questo tumore, e si ritiene sia responsabile osservati. Gli ultimi studi evidenziano inoltre, per i fumatori passivi, un aumento del rischio tra il 20% ed il 50% rispetto ai non fumatori. Nella tesi che andrò a discutere sarà esposto uno dei più importanti metodi di diagnostica per l’adenocarcinoma del polmone, ovverosia la tecnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) per individuare il riarrangiamento del gene ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) in una sottopopolazione equivalente al 3-7% di carcinomi non a piccole cellule.

I pazienti con neoplasia ALK+, età media alla diagnosi di circa 50 anni, in maggioranza non fumatori di sesso maschile, traggono benefici da trattamenti in grado di inibirne selettivamente il meccanismo patogenetico. Infatti, è ormai confermata l’efficacia di Crizotinib, inibitore competitivo della fosforilazione del dominio tirosino-chinasico di ALK rispetto alla chemioterapia. Nonostante la sopravvivenza a cinque anni sia migliorata, il tumore al polmone permane, ancora oggi, come una neoplasia a prognosi particolarmente sfavorevole.

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Sommario

• 1 Introduzione 4
• Capitolo 1 4
• Definizione 4
• Caratteristiche generali 6
• Capitolo 2 6
• Epidemiologia 7
• Classificazione 9
• Eziopatogenesi 10
• Diagnosi 12
• Trattamento 14
• Capitolo 3 14
• Storia del gene 15
• Meccanismo d’azione 15
• Correlazione tra ALK e diversi tumori 16
• Riarrangiamento del gene ALK nei tumori polmonari 17
• Trattamento e resistenza ai farmaci anti-ALK 19
• Capitolo 4 19
• Metodica FISH 20
• Vantaggi e svantaggi della FISH 21
• Tipologia di sonde 22
• Valutazione del riarrangiamento del gene ALK tramite FISH 24
• Capitolo 5 24
• Risultati 26
• Capitolo 6 26
• Conclusioni 28
• Bibliografia 28
• Sitografia 30
• Ringraziamenti 2

Abbreviazioni

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Capitolo 1

I tumori: definizione

La definizione più corretta per descrivere la parola “tumore” è quella coniata dall’oncologo Rupert Allan Willis, accettata a livello internazionale che afferma: “una neoplasia o un tumore è una massa di tessuto che cresce in eccesso ed in modo scoordinato rispetto ai tessuti normali, e che persiste in questo stato dopo la cessazione degli stimoli che hanno indotto il processo”. (1)

Caratteristiche generali

I tumori possono essere divisi in due grandi gruppi: maligni e benigni; essi si differenziano per alcune caratteristiche fondamentali. I primi sono tumori infiltranti, che possono, cioè, attraversare lo stroma e raggiungere varie vie per disseminare, al contrario dei benigni che sono espansivi e rimangono incapsulati. Di fondamentale importanza, per distinguere un tumore maligno da uno benigno, è l’esame citologico ed istologico, effettuato al microscopio da un anatomopatologo (1).

Tra le principali caratteristiche delle cellule tumorali troviamo: l’evasione dall’apoptosi; un ciclo cellulare alterato, in quanto si riproducono in maniera incontrollata e con maggiore frequenza rispetto a una popolazione di cellule sane; la capacità di auto-produrre i fattori di crescita - se un antagonista di questi fattori viene somministrato ad una delle cellule, quest’ultime non risponderanno adeguatamente.

Inoltre, viene persa una caratteristica importante delle cellule sane, ossia l’inibizione da contatto: un meccanismo che consiste nella cessione della crescita, quando le cellule sane entrano in contatto tra di loro.

Si tratta di una peculiarità piuttosto rilevante, perché è grazie a questa perdita che la cellula tumorale può crescere e dividersi in maniera incontrollata, anche rimanendo a contatto con le cellule vicine.

Ultimo aspetto, ma non meno importante, è che le cellule dei tumori maligni generalmente sono poco o indifferenziate presentandosi quindi con un livello di maturazione diverso da quelle sane del tessuto d’origine, e con un elevato grado di malignità a differenza dei tumori ben differenziati che saranno quindi, meno aggressivi. Infine, mostrano alcune caratteristiche aggiuntive atte a promuoverne la crescita incontrollata, grazie all’accumulo di nutrienti derivanti dal sangue dell’organismo ospitante per mezzo dell’angiogenesi - un processo fondamentale in un organismo sano che consiste nella formazione di nuovi vasi sanguigni - da quelli preesistenti, volto alla cicatrizzazione delle ferite, alla crescita del tessuto e a molti processi fisiologici. Nel caso delle cellule tumorali si ha una generazione incontrollata di vasi sanguigni, con lo scopo di raccogliere la maggiore quantità di nutrienti, ma con crescita disordinata e maggiore fragilità strutturale.

Un processo correlato all’angiogenesi, il quale è una caratteristica intrinseca dei tumori maligni, è la formazione di metastasi, costituite da cellule, originarie del tumore primario, che si staccano da esso e migrano nel torrente circolatorio o linfatico, per raggiungere distretti fisici lontani dalla neoformazione originaria. La cascata metastatica è molto complessa in quanto comprende diverse fasi e può variare da tumore a tumore.

Un altro tratto distintivo delle cellule tumorali è la loro capacità di manipolare e riprogrammare il metabolismo. In condizioni normali, la cellula sana, in presenza di ossigeno, predilige la glicolisi - un processo che da una molecola di glucosio produce, prima piruvato e poi, grazie alla fosforilazione ossidativa, origina 38 molecole di ATP (Adenosina Trifosfato), le quali sono la fonte di energia principale della cellula.

Le cellule tumorali, anche in presenza di ossigeno, preferiscono la glicolisi aerobica o effetto Warburg (dal suo scopritore): nonostante questa via risulti, meno efficiente essa produce una maggiore quantità di metaboliti secondari, i quali vengono utilizzati dalle cellule neoplastiche per produrre i costituenti principali dell’unità biologica, al fine ultimo di potersi accrescere.

Altra caratteristica, che è comune a tutte le cellule neoplastiche è l’instabilità genomica. Il DNA può subire dei danni, causati da agenti esterni, ma anche interni, di vario tipo: chimici, fisici, biologici, causati dal metabolismo cellulare oppure dalla replicazione del DNA. Tutti questi agenti possono causare mutazioni, ovvero modificazioni nella composizione della struttura del DNA stesso, alterando di conseguenza il suo messaggio.

Le cellule hanno sviluppato meccanismi di protezione del DNA, in grado di riparare il danno subito. Molto spesso le mutazioni nelle cellule tumorali avvengono proprio nei geni appartenenti ai sistemi di riparazione: questo fa sì che nelle cellule vengano accumulate più mutazioni che conferiscono vantaggi alle cellule, quali maggiore capacità proliferativa o promozione dell’angiogenesi e del processo metastatico (1-2).

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Capitolo 2

I tumori polmonari: epidemiologia

Il tumore al polmone rappresenta la prima causa di morte per neoplasia nei Paesi sviluppati. In Italia il numero di nuovi casi si attesta intorno ai 35-40.000 all’anno. Esso ha una maggiore incidenza negli individui di sesso maschile, 100-110 nuovi casi al giorno su 100.000 abitanti, mentre nelle donne il tasso è circa 20-30 nuovi casi su 100.000.

L’incidenza della malattia aumenta con l’avanzare degli anni, dunque, alla diagnosi, l’età media dei pazienti è di sessanta anni.

All’inizio del secolo scorso, il tumore al polmone era poco considerato a causa della sua bassa incidenza, ma, verso la fine del ventesimo secolo, l’attenzione della ricerca si è spostata su di esso per l’elevato incremento del tasso di mortalità (Fig.1).

Ad oggi il tumore al polmone rappresenta una neoplasia con una prognosi, generalmente, infausta (3).

Figura 1: in questo grafico a mappa colorata, in base all’incidenza dei tumori ai polmoni, possiamo osservare come nella maggior parte dei paesi europei il cancro al polmone è molto diffuso su base continentale.

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Classificazione

La classificazione istopatologia raccomandata è quella della World Health Organization (WHO).

Generalmente, la maggior parte dei casi di tumore al polmone è divisa in quattro istotipi principali: adenocarcinoma (ADC), carcinoma squamoso (CS), carcinoma a grandi cellule (CGC) e il carcinoma a piccole cellule o microcitoma. Negli ultimi anni si è avuto un netto incremento della frequenza degli adenocarcinomi, mentre i restanti istotipi neoplastici sono in diminuzione. Una successiva classificazione delle neoplasie polmonari si è avuta negli ultimi anni con il raggruppamento di tutti quei tumori non a piccole cellule (ADC, CS e microcitoma), sotto un unico istotipo: NSCLC (Non-Small Cell Lung Cancer), il quale è divenuto importante per la valutazione di nuove terapie specifiche per un determinato isotipo, come per esempio l’adenocarcinoma, che di solito è positivo per TFF-1 (Thyroid Transcription Factor-1), citocheratina 7 (CK7) e napsina; mentre il carcinoma squamoso è positivo per le proteine p63, p40, citocheratine ad alto peso molecolare e desmocollina-3 (4).

Procederò, ora, con l’elencare alcune caratteristiche fondamentali per distinguere tra di loro i diversi istotipi (Fig.2):

• Carcinoma squamoso o squamo cellulare.

Si tratta di uno dei più diffusi tumori che colpiscono il polmone, circa il 25-30% delle diagnosi di neoplasie appartengono a questo istotipo.

Solitamente esso si sviluppa nelle vie aeree di maggiore interesse, come per esempio i bronchi e, ovviamente, con l’avanzare della malattia, esso si potrà diffondere ai linfonodi circostanti e ad altre parti del corpo, creando quindi delle metastasi. Gli organi più colpiti da questo processo sono il cervello, le ossa, il fegato, le ghiandole surrenali e varie parti del polmone stesso (5)

• Carcinoma a grandi cellule.

Il 9% dei casi, è costituito da strati o agglomerati di cellule giganti con forma poligonale. Questo tipo di tumore, che si sviluppa nella periferia del sistema respiratorio, forma grandi masse, le quali sono facilmente identificabili tramite una radiografia. Esso è scarsamente differenziato, cioè è privo delle caratteristiche molecolari e citologiche del tessuto di origine e, di conseguenza, la diagnosi risulta più complessa e facilmente confondibile con altre neoplasie polmonari (6)

• Carcinoma a piccole cellule o microcitoma.

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Rappresenta una delle più aggressive tra le neoplasie maligne che colpiscono il polmone. È diffusa nel 10-15% dei casi totali di tumori diagnosticati al polmone, ed è caratterizzata da una crescita rapida e da metastasi precoci, impedendone la diagnosi tempestiva. Macroscopicamente viene identificata tramite una massa ilare di notevoli dimensioni. Generalmente, ne risentono pazienti anziani con storie di serio tabagismo. A livello microscopico questo tumore presenta delle piccole cellule ovali, con alta conta mitotica, (il numero totale di mitosi visualizzabile attraverso l’osservazione del vetrino) e necrosi tissutale (7)

• Adenocarcinoma.

È il tumore più frequente, con una percentuale di diagnosi del 30-40% ed è molto comune nelle persone di sesso femminile e non fumatrici. Si sviluppa nella periferia dell’apparato respiratorio, vicino alle pleure, crescendo più lentamente rispetto al carcinoma a piccole cellule.

Microscopicamente, osserviamo la presenza di strutture simil ghiandolari, mentre, macroscopicamente, si nota una massa bianca e spugnosa, che occupa la parte periferica del sistema respiratorio. Se diagnosticato in tempo, è possibile curare questo tumore.

Si ha, però, anche una spiccata dote metastatica, che si sviluppa attraverso tre vie principali: diffusione per contiguità, ematogena e linfatica (4)

A BDC 8

Figura 2: possiamo osservare, esempi di tessuti patologici.