Report laboratori di microbiologia applicata

Laboratorio di microbiologia generale

Introduzione

La prima esperienza di laboratorio aveva lo scopo di permetterci di imparare a mettere in atto alcune procedure che avevamo trattato a livello teorico a lezione. Nello specifico sono state svolte diluizione e piastramento, isolamento in coltura pura, colorazione di Gram, prove di fermentazione e verifica della presenza dei seguenti enzimi: catalasi, amilasi e proteasi nei microrganismi presi in esame.

Determinazione della carica vitale

Scopo

Determinare quante cellule vive e in grado di dare origine a unità formanti colonia su terreno agarizzato sono presenti nel campione.

Materiali e metodi:

• Campione di terra prelevato nel cortile di via Mangiagalli 25
• Bilancia tecnica
• Vortex
• Beuta
• Provette di vetro
• Pipette sterili monouso
• Propipette
• Becco Bunsen con fiamma ossidante per lavorare in sterilità
• 2 piastre petri contenenti terreno nutrient agar, è un terreno povero poco costoso, adatto a microrganismi poco esigenti
  • Estratto di carne 3g/L
  • Peptone 5 g/L
  • Agar 15 g/L
  • Acqua distillata
• 2 piastre petri contenenti terreno malt agar
  • Estratto di malto 30 g/L
  • Agar 17 g/L
  • Acqua distillata
• Provette
• Soluzione salina
• Spatole a L

Diluizioni seriali decimali

Si devono fare diluizioni decimali seriali in modo da avere un numero di colonie contabile (tra 30 e 300). Un numero superiore alle 300 colonie sarebbe molto complesso da contare, ma è importante non stare neppure sotto alle 30 colonie perché si otterrebbe un risultato non accettabile a livello statistico. Gli errori in questo metodologia possono derivare, per esempio, dal piastramento, dalla complessità del campione (omogeneizzare uno yogurt è più semplice che un campione di terra), dalla manualità dell’operatore. È buona norma prevedere delle repliche della misurazione in modo da ottenere un risultato affidabile.

Come prima cosa siglare le provette con le diluizioni corrispondenti: -1,-2,-3,-4,-5,-6. Preparare il campione inserendo 10 g di terra in 90 mL di soluzione salina (9 g/l di NaCl, è una soluzione fisiologica che non causa stress osmotico nelle cellule, altrimenti non potremmo misurare le cellule vive. Non si usa mai acqua che creerebbe, al contrario, stress osmotico) all’interno di una beuta, in modo da realizzare la prima diluizione. Omogeneizzare la provetta mediante il vortex, prelevare 1 mL di sospensione utilizzando una pipetta raccordata ad una propipetta (che permette di aspirare il volume desiderato) ed inserirlo nella provetta -2 che contiene già 9 mL di soluzione fisiologica. Omogeneizzare la provetta -2 mediante il vortex e, come prima, prelevare 1 mL di sospensione per poi inserirlo nella provetta -3 che contiene 9 mL di soluzione fisiologica. Proseguire allo stesso modo sino ad arrivare alla diluzione -6.

È buona norma spostare le provette man mano che si riempiono in modo da non rischiare di confonderle con quelle che devono ancora essere utilizzate. Dopo la terza diluizione il contenuto di queste non sarà più torbido e quindi sarà facile confondersi. Le diluizioni seriali decimali devono essere compiute nell’intorno della fiamma ossidante. Ad ogni diluizione si deve usare una pipetta sterile monouso nuova raccordata ad una propipetta e flambare sulla fiamma le provette. In ciascuna delle procedure che sono state svolte in laboratorio è essenziale lavorare in sterilità. Il campione non deve essere in alcun modo contaminato in modo da ottenere risultati rappresentativi della realtà.

Piastramento per spatolamento

Marcare 2 piastre contenenti terreno solido nutrient agar con il numero della diluizione (-3 e -4) e il nome del terreno. Marcare 2 piastre contenenti terreno solido malt agar con il numero della diluizione (-2 e -3) e il nome del terreno. Prelevare 100 µL dalla diluizione -4 mediante l’utilizzo di una pipetta monouso sterile raccordata ad una propipetta e scaricarli nella piastra Petri con il terreno Nutrient agar siglata con la diluizione -4. Fare lo stesso con la diluizione -3 utilizzando la stessa pipetta. Tenere il coperchio della piastra sollevato e spargere i microrganismi mediante una spatola a L sterile avendo cura di spargerli su tutta la piastra finché si sente attrito, indice che il liquido è stato completamente assorbito dal terreno. Partire dalla diluizione -4 e utilizzare la stessa spatola per la -3. Anche in questo caso si deve lavorare nell’intorno della fiamma ossidante. Effettuare la stessa procedura per il terreno malt agar. Incubare a 30°C per 48h in anaerobiosi.

Per creare l’anaerobiosi si utilizzano delle giare all’interno della quali si inseriscono delle strisce che contengono sali di ferro. Le strisce vengono bagnate in modo da catalizzare la reazione di ossidazione del ferro utilizzando l’ossigeno che viene ridotto ad anidride carbonica.

Risultati

Dalla foto si vede chiaramente la progressiva diminuzione del numero di colonie nelle piastre all’aumentare della diluizione. La procedura è stata quindi svolta in modo corretto. Trascorso il tempo di anaerobiosi contare le colonie segnandole man mano con un pennarello. Sono considerate contabili le piastre che contengono dalle 30 alle 300 colonie. Nel terreno nutrient agar sono state contate 21 colonie nella diluizione -4, a scopo didattico sono state considerate, ma se fosse stato un controllo qualità la piastra sarebbe dovuta essere scartata. Nella piastra malt agar sono state contate 200 colonie nella diluizione -3. Si utilizza la formula per due diluizioni e una replica -3 6N = Σ C / V × 1,1 x d = (21 + 200) / (0,1 * 1,1 * 10 ) = 2 * 10 UFC/g.

Isolamento in coltura pura

Scopo

Ottenere delle colture pure a partire da uno slant contente biomassa mediante la tecnica dello striscio che permette di separare le colonie. Questa tecnica non può essere usata per la conta vitale perché non si vanno ad inserire nelle piastre volumi noti di sospensione.

Materiali e metodi:

• Becco Bunsen con fiamma ossidante per lavorare in sterilità
• Anse sterili monouso
• Slant con Bacillus licheniformis
• 2 piastre petri contenenti terreno nutrient agar

Lo slant è costituito da un tubo di vetro con terreno agarizzato sul quale è stato fatto crescere un microrganismo poco esigente: Bacillus licheniformis in coltura pura. Flambare il tubo e prelevare poca biomassa dallo slant mediante un’ansa sterile monouso. Porre la biomassa su di una piastra petri contenente terreno nutrient agar. Effettuare uno striscio su metà della piastra tenendo l’ansa parallela al terreno e senza effettuare una pressione troppo intensa. Effettuare lo stesso sui due quarti rimasti liberi. In questo modo si otterrà una crescita non confluente delle colonie. Il tutto deve essere fatto nell’intorno della fiamma ossidante. Scrivere cosa contiene la piastra dalla piastra dell’agar e incubare la piastra a 30°C per 24/48h in anaerobiosi. Per creare l’anaerobiosi si utilizzano delle giare all’interno della quali si inseriscono delle strisce che contengono sali di ferro. Le strisce vengono bagnate in modo da catalizzare la reazione di ossidazione del ferro utilizzando l’ossigeno che viene ridotto ad anidride carbonica. Una volta cresciute le colonie prelevare della biomassa da una colonia singola mediante un’ansa monouso sterile ed effettuare uno striscio su di una nuova piastra petri contenente nutrient agar. Incubare la piastra a 30°C per 24/48 h in anaerobiosi.

Risultati

La procedura è stata eseguita in modo corretto. Si è quindi ottenuta una coltura pura poiché nella piastra si possono osservare colonie ben separate, simili per forma, colore e dimensione.

Caratterizzazione fenotipica di un isolato ambientale - visualizzare le attività enzimatiche

Scopo

Discriminare la presenza dei seguenti enzimi: amilasi, proteasi e catalasi in Bacillus licheniformis.

Materiali e metodi:

• Anse monouso sterili
• Reattivo di Lugol
• Pipetta
• Acqua ossigenata
• Piastra petri con terreno Agar Latte
  • Skimmed milk 100 g/L
  • Agar 15 g/L
  • Acqua distillata
• Piastra petri con terreno Agar amido
  • Meat extract 3g/L
  • Peptic digest of animal tissue 5g/L
  • Starch, soluble 2g/L
  • Agar 15 g/L
• Piastra petri con terreno Nutrient Agar
  • Estratto di carne 3g/L
  • Peptone 5 g/L
  • Agar 15 g/L
  • Acqua distillata
• Slant con Bacillus licheniformis

Valutazione dell’attività proteolitica nei confronti delle caseine del latte

Utilizzando un’ansa sterile monouso si effettua uno striscio della coltura pura di Bacillus licheniformis su una piastra contenente terreno Agar Latte. Il tutto deve essere effettuato nell’intorno della fiamma ossidante. Incubare a 30°C per 24/48h.

Valutazione dell'attività amilasica

Utilizzando un’ansa sterile monouso si effettua uno striscio della coltura pura di Bacillus licheniformis su una piastra contenente terreno Agar Amido. Il tutto deve essere effettuato nell’intorno della fiamma ossidante. A seguito della crescita delle colonie si inseriscono nella piastra 200-300 µL di reattivo di Lugol mediante una pipetta. Aggiungere una goccia di Lugol dove non ci sono microrganismi, in modo da avere il controllo negativo. Questo reattivo, composto da iodio e ioduro di potassio è in grado di intercalarsi nelle catene di amilosio, a seguito di ciò il suo colore vira da giallo a blu.