Domande e risposte Qualità e sicurezza microbiologica ed Ecologia del microbiota umano

Domande e risposte: qualità e sicurezza microbiologica e microbiota umano

Ecologia del microbiota

1) Descrivi la classificazione dei viventi e spiega cosa si intende con tassonomia.

La classificazione dei viventi si basa su un sistema gerarchico che organizza gli organismi in gruppi basati su caratteristiche comuni. Tradizionalmente, la classificazione include cinque regni: Monera (procarioti, batteri e archeobatteri), Protisti, Funghi, Piante e Animali. Nel 1990, Carl Woese introdusse una classificazione in tre domini: Bacteria, Archaea ed Eukarya. La tassonomia è la scienza che si occupa della classificazione e della nomenclatura degli organismi e utilizza una struttura gerarchica che comprende dominio, regno, phylum, classe, ordine, famiglia, genere e specie. La nomenclatura binomiale, introdotta da Carlo Linneo, assegna a ogni organismo un nome scientifico composto da due parti: genere e specie, ad esempio Homo sapiens.

2) Descrivi il concetto biologico di holobionte.

Il termine holobionte si riferisce a un organismo ospite e ai microrganismi che vivono in simbiosi con esso. È costituito dall’insieme delle cellule eucariotiche dell’ospite e delle cellule microbiche (batteri, virus e funghi). L’essere umano è un holobionte poiché ospita un ampio numero di microrganismi che influenzano molte funzioni biologiche. L’interazione tra ospite e microbiota è dinamica e influenza digestione, immunità e metabolismo. Ad esempio, intestino e vagina sono ricchi di lattobacilli che producono acido lattico e mantengono un ambiente acido inibendo i patogeni.

3) Spiega la differenza tra microbiota e microbioma.

Il microbiota è l’insieme di tutte le cellule microbiche che colonizzano un ambiente specifico; nel corpo umano comprende batteri, funghi, virus e altri microrganismi presenti in nicchie come intestino, bocca, pelle e vagina. Il microbioma è un concetto più ampio che include, oltre al microbiota, anche l’habitat, i metaboliti prodotti, i genomi e le interazioni con l’ambiente. Rappresenta quindi l’intero sistema funzionale dei microrganismi in un ecosistema.

4) Descrivi le differenze tra culturomica e metagenomica.

La culturomica si basa sulla coltivazione dei microrganismi in laboratorio, seminando i campioni su terreni di coltura per isolare colonie batteriche. Permette di studiare i microrganismi coltivabili, ma è limitata perché solo circa l’1% è coltivabile. La metagenomica, invece, analizza direttamente il DNA estratto dai campioni ambientali senza coltivazione, permettendo di studiare l’intera comunità microbica, inclusi i microrganismi non coltivabili. Offre una visione più completa, ma non consente lo studio isolato dei singoli microrganismi.

5) Spiega cos’è il gene 16S rRNA e a quale scopo viene utilizzato nello studio del microbiota.

Il gene 16S rRNA è una porzione di DNA presente nei procarioti (batteri e archei), altamente conservata ma con regioni variabili che permettono di distinguere le specie. È utilizzato per l’identificazione tassonomica perché contiene regioni conservate per primer universali e regioni variabili che fungono da impronta digitale. Nello studio del microbiota viene sequenziato per determinare la composizione microbica di un campione senza necessità di coltivazione ed è una tecnica di metagenomica.

6) Nomina almeno due campi di ricerca in cui il sequenziamento degli acidi nucleici ha dato un grosso contributo e spiega il motivo.

Il sequenziamento del DNA ha dato un grande contributo in diversi campi. In medicina genomica ha rivoluzionato l’identificazione di mutazioni genetiche responsabili di malattie ereditarie e predisposizioni al cancro, permettendo lo sviluppo di terapie personalizzate basate sul profilo genetico individuale e migliorando l’efficacia dei trattamenti. Nell’ecologia microbica, in particolare nello studio del microbiota umano, il sequenziamento consente di identificare e classificare le specie batteriche presenti in un campione, anche non coltivabili, ad esempio tramite il sequenziamento del gene 16S rRNA. Anche in agricoltura e nelle biotecnologie il sequenziamento è fondamentale per migliorare le colture, selezionare caratteristiche desiderate e sviluppare organismi geneticamente modificati.

7) Descrivi il procedimento di sequenziamento di prima generazione Sanger.

Il sequenziamento Sanger utilizza una reazione di terminazione della catena per determinare l’ordine delle basi del DNA. Si prepara una miscela contenente DNA stampo, primer, DNA polimerasi, nucleotidi normali (dNTPs) e nucleotidi terminatori (ddNTPs) marcati con fluorocromi diversi per ciascuna base. I ddNTPs mancano del gruppo ossidrile in posizione 3’, impedendo la formazione del legame fosfodiesterico e arrestando la sintesi del DNA. Durante la reazione si formano frammenti di diversa lunghezza terminati con nucleotidi marcati. I frammenti vengono separati mediante elettroforesi capillare e un laser rileva la fluorescenza per identificare le basi terminali. Analizzando i frammenti si ricostruisce la sequenza del DNA.

8) Spiega il concetto che sta dietro all’utilizzo dei dideossinucleotidi nel sequenziamento Sanger.

I dideossinucleotidi (ddNTPs) sono nucleotidi privi del gruppo ossidrile in posizione 3’, necessario per l’allungamento della catena di DNA. Quando un ddNTP viene incorporato, la sintesi si arresta perché non può formarsi il legame fosfodiesterico. Poiché ogni ddNTP è marcato con un fluorocromo diverso, è possibile identificare la base che ha causato la terminazione. Questo permette di ottenere frammenti di diversa lunghezza, ciascuno terminato con una base specifica, consentendo la determinazione della sequenza.

9) Descrivi la tecnica su cui si basa il sequenziamento di seconda generazione (NGS).

Il sequenziamento di seconda generazione, come quello Illumina, si basa sulla parallelizzazione del processo. Il DNA viene frammentato e ligato ad adattatori, poi i frammenti si legano a un supporto solido. Avviene una amplificazione a ponte (clusterizzazione) che genera molte copie di ogni frammento, aumentando il segnale. I nucleotidi vengono aggiunti uno alla volta e ogni incorporazione è rilevata tramite un segnale fluorescente. La lettura avviene base per base e in parallelo su migliaia di frammenti, permettendo di ottenere grandi quantità di dati in tempi rapidi.

10) Spiega su cosa si basa il quality control delle reads derivanti dal sequenziamento Illumina.

Il controllo qualità delle reads si basa sull’analisi della qualità delle basi sequenziate tramite lo score di Phred, che indica la probabilità di errore nella lettura di ciascuna base. Valori elevati indicano alta affidabilità, mentre valori bassi indicano possibili errori. Vengono generati grafici di qualità per ogni posizione della sequenza per individuare regioni meno affidabili. Le sequenze con qualità troppo bassa possono essere filtrate ed escluse dalle analisi successive.

11) Descrivi il funzionamento del sequenziamento di terza generazione Nanopore.

Il sequenziamento Nanopore permette di leggere il DNA in tempo reale mentre attraversa un poro proteico inserito in una membrana. Il passaggio del filamento di DNA attraverso il poro provoca variazioni nel flusso di corrente elettrica. Ogni base determina una variazione caratteristica del segnale elettrico, che viene misurata e interpretata per identificare la sequenza. Questa tecnologia consente letture molto lunghe senza necessità di amplificazione o marcatori fluorescenti.

12) Spiega cosa si intende per assemblare e annotare un genoma.

Assemblare un genoma significa ricostruire la sequenza completa del DNA di un organismo a partire da frammenti di sequenza (reads), allineandoli e unendoli correttamente. Annotare un genoma significa identificare le regioni funzionali della sequenza, come geni, open reading frames, promotori e sequenze regolatrici. Questo processo consente di comprendere quali parti codificano per proteine, le funzioni dei geni e i meccanismi di regolazione del genoma.

13) Descrivi brevemente i principali step della pipeline di QIIME2.

Il primo step è il demultiplexing, in cui le sequenze vengono separate in base ai diversi campioni utilizzando barcode unici; le sequenze inizialmente mescolate vengono assegnate correttamente ai rispettivi campioni. Il secondo step è la clusterizzazione e costruzione della feature table: le sequenze simili vengono raggruppate in cluster con una soglia di identità (circa 98,7%), da cui si seleziona una sequenza rappresentativa per costruire alberi filogenetici e assegnare la tassonomia; si genera così la feature table con i cluster e le loro abbondanze. Il terzo step è l’assegnazione tassonomica, in cui le sequenze rappresentative vengono classificate identificando i taxa presenti. Il quarto step è la predizione funzionale, che tramite strumenti come PICRUSt2 permette di inferire le potenziali funzioni microbiche, pur con un certo margine di errore.

14) Descrivi i concetti di alpha e beta diversity.

L’alpha diversity misura la diversità all’interno di un singolo campione e si basa su metriche come la richness (numero totale di specie) e la evenness (distribuzione uniforme delle abbondanze tra specie). La presenza di specie rare, come i singleton, suggerisce una maggiore diversità potenziale. La beta diversity misura invece la diversità tra campioni diversi, confrontando specie condivise e specie uniche; utilizza indici come Bray-Curtis (basato sulle abbondanze relative) e Jaccard (basato su presenza/assenza). I risultati vengono spesso visualizzati con tecniche come PCA o PCoA per evidenziare pattern tra campioni.

15) Spiega che cos’è la rarefaction curve e a quale scopo viene utilizzata.

La curva di rarefazione è una tecnica statistica usata per confrontare la diversità tra campioni con diverso sforzo di campionamento. Simula un campionamento uniforme riducendo il numero di osservazioni a un minimo comune, permettendo di stimare la diversità attesa. La curva mostra l’aumento della biodiversità con il numero di individui osservati e, quando raggiunge un plateau, indica che la maggior parte delle specie è stata campionata. È fondamentale per confrontare campioni in modo corretto.

16) Elenca e spiega il significato delle tre caratteristiche della tabella descrittiva del microbioma.

La composizionalità dei dati indica che i valori rappresentano proporzioni relative e non abbondanze assolute. La sparsità della tabella indica la presenza di molti zeri, dovuti al fatto che molte specie compaiono in pochi campioni; questi zeri possono essere reali o dovuti a limiti di rilevazione. La multivariabilità indica un elevato numero di variabili (specie o geni) rispetto ai campioni, generando alta dimensionalità e richiedendo tecniche di riduzione come PCA o analisi multivariate.

17) Parla del ruolo della normalizzazione dei dati e perché è necessaria.

La normalizzazione dei dati è necessaria per confrontare correttamente i campioni, eliminando differenze dovute a diverse profondità di sequenziamento. Nei dati di microbioma si utilizzano metodi come il total sum scaling o approcci basati su distribuzioni come la binomiale negativa per rendere confrontabili le abbondanze. La normalizzazione riduce anche l’influenza delle specie molto abbondanti e migliora l’affidabilità delle analisi, in particolare per le specie rare.

18) Descrivi l’andamento del microbiota durante le varie fasi di vita dell’uomo.

Il microbiota umano cambia nel corso della vita, dalla nascita alla vecchiaia. Alla nascita il neonato è quasi sterile, ma viene rapidamente colonizzato da microrganismi ambientali, con predominanza iniziale di lattobacilli. Nei primi 1000 giorni di vita il microbiota aumenta in diversità grazie a fattori come tipo di parto, allattamento ed esposizione ambientale; l’allattamento al seno favorisce i bifidobatteri, importanti per il sistema immunitario. Durante infanzia ed età adulta il microbiota raggiunge massima stabilità e diversità, soprattutto tra i 20 e i 40 anni. Con l’invecchiamento si osserva una riduzione della diversità microbica e una perdita di taxa benefici, con possibili effetti su infiammazione e suscettibilità alle infezioni.

19) Spiega la differenza del microbiota nel neonato tra parto naturale e parto cesareo.

Nel parto naturale il neonato acquisisce microbi dalla madre, soprattutto dal canale vaginale e intestinale, con predominanza di lattobacilli e bifidobatteri, fondamentali per lo sviluppo immunitario. Nel parto cesareo il microbiota iniziale è dominato da batteri cutanei come stafilococchi e corinebatteri, con minore presenza di batteri benefici. Questo comporta una minore diversità e un aumentato rischio di sviluppare obesità, asma e malattie autoimmuni.

20) Spiega l’importanza del latte materno nell’evoluzione del microbiota del neonato.

Il latte materno è fondamentale per lo sviluppo di un microbiota sano. Contiene oligosaccaridi (HMO) che favoriscono la crescita di bifidobatteri, utili per la digestione e il sistema immunitario. Inoltre fornisce anticorpi e componenti immunomodulanti che proteggono dalle infezioni. I neonati alimentati con formule artificiali presentano generalmente minore diversità batterica e maggiore presenza di batteri gram-negativi.

21) Descrivi l’effetto degli antibiotici sui neonati.

L’uso di antibiotici nei primi mesi di vita può alterare significativamente il microbiota, riducendo i bifidobatteri e favorendo batteri potenzialmente patogeni. Si osserva una riduzione della diversità microbica anche a distanza di tempo. Questo può aumentare il rischio di infezioni, malattie autoimmuni e altri disturbi a lungo termine, oltre a favorire lo sviluppo di antibiotico-resistenza.

22) Descrivi come si possono raggruppare i soggetti anziani in base al microbiota e le conseguenze.

Si distinguono tre gruppi. Gli “healthy aging” presentano una maggiore presenza di Faecalibacterium bifidobatteri e produttori di acidi grassi a corta catena come prausnitzii, associati a bassa infiammazione e protezione metabolica. Gli “unhealthy aging” mostrano prevalenza di patobionti, con maggiore infiammazione e rischio di malattie come diabete e patologie cardiovascolari. Il gruppo “long-lived” comprende individui con microbiota capace di produrre acidi biliari secondari benefici, come l’acido isoallolitocolico, associati a longevità e buona salute metabolica.

23) Descrivi i lati positivi e negativi degli acidi biliari secondari.

Gli acidi biliari secondari possono avere effetti benefici, come modulare il microbiota, regolare l’infiammazione e proteggere dalle infezioni intestinali, oltre a influenzare positivamente metabolismo e salute epatica. Tuttavia, a livelli elevati, alcuni come acido desossicolico e litocolico possono essere tossici, favorire infiammazione intestinale, danno epatico e aumentare il rischio di tumore del colon-retto.

24) Descrivi il funzionamento della zonulina, il suo ruolo nella permeabilità intestinale e l’intervento alimentare associato.

La zonulina è una proteina che regola la permeabilità intestinale. Livelli elevati aumentano la permeabilità (“leaky gut”), permettendo il passaggio di tossine e antigeni nel sangue, con conseguente infiammazione e rischio di malattie metaboliche e autoimmuni. Una dieta ricca di polifenoli, come la dieta mediterranea, è stata associata a una riduzione dei livelli di zonulina e a un miglioramento dell’integrità della barriera intestinale.

25) Parla dell’effetto del microbioma sulla longevità.

I centenari presentano un microbioma caratteristico associato a longevità in salute, con maggiore presenza di batteri produttori di acidi biliari secondari benefici e metaboliti antinfiammatori derivati dal triptofano. Rispetto ad altre fasce di età, mostrano una maggiore abbondanza di specie protettive contro patogeni. Un’elevata diversità microbica, supportata da una dieta ricca di fibre e polifenoli, è associata a riduzione dell’infiammazione e maggiore resilienza fisiologica, contribuendo a una vita più lunga e sana.

26) Principali perturbazioni del microbiota e meccanismi di difesa.

Il microbiota intestinale è soggetto a diverse perturbazioni, tra cui fattori genetici, età, dieta, stress, attività fisica, antibiotici e modalità del parto. Gli antibiotici possono causare disbiosi eliminando batteri essenziali e alterando l’equilibrio microbico, mentre una dieta povera di fibre e ricca di grassi animali riduce la diversità. Il microbiota si difende tramite ridondanza funzionale, cioè la presenza di batteri con funzioni simili, e tramite elevata diversità alfa, che aumenta resistenza e resilienza. La resistenza permette di mantenere la struttura nonostante le perturbazioni, mentre la resilienza consente il ritorno allo stato iniziale. Se la perturbazione è molto forte, il microbiota può passare a uno stato alternativo stabile (disbiosi), da cui è difficile uscire senza ulteriori interventi.

27) Enterotipi e associazione con la dieta.

Gli enterotipi sono configurazioni del microbiota intestinale associate a specifiche abitudini alimentari e batteri dominanti. L’enterotipo Bacteroides è tipico di diete ricche di proteine animali e grassi, comuni nei paesi occidentali. L’enterotipo Prevotella è associato a diete ricche di fibre e carboidrati complessi, tipiche di popolazioni tradizionali o con dieta mediterranea. L’enterotipo Ruminococcus è legato a diete miste e alla degradazione di polisaccaridi complessi. Questi enterotipi sono relativamente stabili ma possono cambiare con modifiche significative della dieta.

28) Importanza degli acidi grassi a corta catena (SCFAs).

Gli acidi grassi a co