Purificazione proteine, tecniche di laboratorio

Purificazione delle proteine

Purificazione di un enzima

L'interno delle cellule è una specie di gel costituito da tantissime molecole ammassate tra loro. Se vogliamo studiare con metodi della biochimica proteine e enzimi, dobbiamo isolarli da tutti gli altri contaminanti. L'enzima deve essere purificato e attivo, in modo che possiamo misurare le sue caratteristiche funzionali.

L'enzima può essere purificato anche perché si devono svolgere delle applicazioni biotecnologiche: l'enzima serve a catalizzare reazioni utili e quindi è necessario averlo in forma pura.

Linee guida per purificazione

• Bisogna conoscere bene il materiale di partenza, cioè la fonte dell'enzima.
• Bisogna avere un sistema per seguire il processo man mano che avanza, cioè dobbiamo poter misurare l'attività dell'enzima.
• Lo schema di purificazione deve essere il più efficace possibile, quindi deve essere veloce e comprendere non troppi passaggi per ridurre il rischio di denaturazione dell'enzima.
• Si usano basse temperature per evitare denaturazioni o danni di tagli proteolitici a carico dell'enzima stesso.
• I metodi di purificazione si basano su concetti chimico-fisici o su aspetti funzionali molecolari.
• Se siamo in grado di identificare un passaggio di purificazione particolarmente efficace, conviene usarlo il più presto possibile per ottenere un grado di purezza precoce dell'enzima.

Tabella di purificazione

Inizialmente il campione è chiamato omogenato grezzo perché il campione biologico viene distrutto per estrarre gli enzimi e poi ci sono vari passaggi di purificazione. L'ammonio solfato significa che si usa un sale per la precipitazione, una cromatografia di scambio ionico, una di affinità, una per gel di filtrazione e infine una cristallizzazione.

• Unità totali: tutto l'enzima presente nel preparato. Man mano che svolgiamo la purificazione le unità totali diminuiscono. È difficile ottenere le stesse unità totali con resa del 100%. Questo si deve a motivi diversi: delle unità totali si possono perdere perché l'enzima si è denaturato o perché durante le purificazioni, pur di mantenere l'enzima puro, si preferisce sacrificare un po' di unità enzimatiche ancora contaminate con proteine. Potrebbe succedere che nell'omogeneizzato grezzo c'era un enzima e un inibitore e facendo purificazione abbiamo allontanato l'inibitore e in questo caso ci troviamo più unità totali.
• Attività specifica: misura che ci dà un'idea della purezza dell'enzima. All'inizio l'attività specifica è bassa. Questo valore è il rapporto tra unità di ml e i mg per ml di proteina. Fornisce indicazione di quanto enzima c'è nella preparazione. Se la purificazione funziona, otteniamo un valore maggiore dell'attività specifica, che indica un corretto processo di purificazione.
• Resa: rapporto tra unità totali del passaggio successivo e unità totali del passaggio precedente.
• Fattore di purificazione: indice che indica quanto è stato efficace un passaggio di purificazione.

Esempio di purificazione

Immaginiamo due contenitori di laboratorio e ogni proteina è rappresentata da una pallina di vario colore, l'enzima che ci interessa è una pallina rossa. Il primo contenitore rappresenta la situazione iniziale quando ci sono tutte le proteine dell'estratto cellulare; il secondo contenitore rappresenta la proteina già a un certo stato di purificazione. Il numero di palline rosse è costante, quindi le unità totali sono uguali; il primo contenitore però ha altri enzimi che contaminano la preparazione e contribuiscono alla quantità totale di proteine. In questo caso l'attività specifica (unità rosse/unità totali) è bassa. Quando abbiamo applicato il processo di purificazione, abbiamo eliminato gran parte delle proteine contaminanti. Quindi l'attività specifica è più elevata.

Processo di frazionamento

Quando un enzima deve essere purificato, il primo punto è isolare l'enzima dal resto del preparato tramite omogeneizzazione, cioè il campione biologico deve essere rotto perché al suo interno c'è l'enzima. Successivamente, separazioni sono effettuate mediante variazione della solubilità indotte nel campione o separazione mediante tecniche cromatografiche.

Omogeneizzazione

Consiste nel rompere membrane o pareti cellulari che contengono enzimi e rilasciare componenti intracellulari. La sua ottimizzazione avviene a seguito di prove empiriche; si fanno prove e si valuta quelle che danno risultati migliori. L'omogeneizzazione cambia a seconda del campione biologico di partenza. In base a questo si stabilisce il metodo di rottura delle cellule, ma anche in base ad altri aspetti, per esempio se l'enzima è citosolico o si trova in un organello. Bisogna infine tenere conto delle proprietà chimico-fisiche delle soluzioni per evitare che l'enzima venga denaturato durante il processo.

Materiale da esperimento

• Campioni animali (cavie ratti, invertebrati, piante)
• Organi o tessuti isolati
• Cellule batteriche
• Cellule eucariotiche (animali, vegetali)
• Sistemi acellulari
• Organelli isolati
• Molecole isolate

Purificazione di proteine ricombinanti

Proteine ricombinanti sono il risultato del clonaggio di un gene, quindi l'isolamento di un gene e il suo inserimento in un organismo ospite, la sua espressione in modo da produrre quella proteina in maniera preponderante nell'organismo ospite che quindi è geneticamente modificato.

Le proteine ricombinanti si possono esprimere in batteri o in cellule superiori, come cellule stabilizzate per esempio enzimi che si devono produrre con modifiche post traduzionali come glicosilazioni. Queste proteine vengono prodotte in questo modo per motivi di studio poiché è più semplice mettere a punto sistemi di lisi su E.coli piuttosto che andare alla fonte ogni volta. Inoltre, queste proteine possono essere impiegate in varie applicazioni biotecnologiche in campo medico o anche di altro tipo.

Sistemi di omogeneizzazione

• Scegliere metodo di lisi
• Scelta del tampone in cui rompere le cellule
• Scelta della temperatura che deve essere bassa
• Uso di soluzioni isotoniche come saccarosio, glicerolo per evitare movimenti di liquido che possano diluire la soluzione
• Uso di inibitori di proteasi per bloccare proteasi endogene
• Utilizzo di agenti riducenti come mercaptoetanolo che mantiene in stato ridotto le cisteine delle proteine per evitare che si formino ponti disolfuro che possono determinare unfolding delle proteine
• Impiego di composti antibatterici come sodio azide
• Uso di detergenti per favorire la lisi della membrana plasmatica

Metodi di omogeneizzazione

Un metodo semplice di omogeneizzazione è il metodo frizionale solido. In un mortaio, il composto viene sottoposto a macinazione con sabbia o polvere di quarzo. È un metodo energetico usato per cellule vegetali.

Metodi frizionali liquidi

• Si rompono le cellule con shock osmotico e di pH. La cellula scoppia perché si trova in un mezzo che porta una grande quantità di liquido al suo interno.
• Lisi per congelamento/scongelamento
• Digestione della parete con enzimi (lisozima che lisa parete cellulare batterica, liticase, zimolase, chitinase)
• Solubilizzazione chimica (acetone, detergenti, agenti caotropici)
• Sonicazione: uso di ultrasuoni
• French press: passare cellule sotto pressione all'interno di capillari
• Waring Blenders
• Omogeneizzazione (potter, frullatore) usano lame

Si prende un tessuto, lo si mette in sospensione per separare alcune cellule dal resto, poi si può operare per sonicazione e quindi sottoporre cellule a onde sonore che le rompono; oppure si forzano le cellule tramite forellino sotto pressione che le rompe; oppure detergenti a bassa concentrazione per creare buchi nelle membrane perché i detergenti hanno una componente lipidica che entra nella membrana creando fori.

Sonicatore

Omogeneizzazione con ultrasuoni a elevata potenza. La macchina ha una sonda che è immersa in un becher e che emette ultrasuoni.

Separazione mediante variazione della solubilità

Dopo l'omogeneizzazione abbiamo quello che viene chiamato estratto crudo o grezzo, contenente tutti i componenti cellulari.

Le proteine fra loro possono avere diversa solubilità perché la solubilità dipende dalle forze che ci sono tra molecole di soluto e tra molecole di soluto e solvente. Si tratta di cambiare questo equilibrio e portare un soluto dall'interazione con un certo solvente o con un altro soluto a un altro solvente. Si tratta di aggiungere un solvente che porta i soluti ad aggregarsi e quindi a precipitare.

L'aggregazione delle proteine varia a seconda della componente idrofobica superficiale della proteina: maggiore è la componente idrofobica, maggiore queste proteine tenderanno a interagire con altre strutture non polari.

Vantaggi del metodo di separazione

• Riduzione di volume perché vogliamo tenerci la nostra proteina e non le altre. Se aggiungiamo un solvente questo determina che solo certe proteine si aggregano e precipitano e noi prendiamo proteine rimaste che non sono precipitate. Se a quest'altra soluzione aggiungiamo un altro solvente abbiamo che a precipitare è la nostra proteina. In questo modo troviamo pellet, cioè grumetto che si forma sul fondo del recipiente. Quando la proteina si trova nel pellet la possiamo risospendere in una soluzione del volume che vogliamo quindi possiamo ridurre il volume rispetto a quello di partenza.
• Parziale purificazione del campione
• Adatta a passaggi preliminari

Questo metodo spesso si realizza usando Sali, cioè ioni carichi. La forza ionica dipende dalla concentrazione molare delle specie ioniche e dalla carica dello ione.

^{μ = 1/2 S ci Zi2}

Sull'asse delle x c'è la forza ionica, sull'asse y c'è il log della solubilità della carbossiemoglobina. Questa proteina ha solubilità diversa in presenza di diversi Sali perché alla stessa forza ionica, la solubilità dell'emoglobina è molto più bassa in solfato di potassio, un po' più solubile in ammoniosolfato e sempre più solubile in solfato di magnesio e così via.

Andamento non è lineare perché è stato osservato che le proteine seguono due fenomeni opposti che dipendono dalla concentrazione dei sali.

Fenomeno del salting in e salting out

A basse concentrazioni di Sali si osserva il fenomeno salting in: la proteina entra nella soluzione e tende ad essere più solubile. Motivo è che cariche del sale permettono dispersione delle cariche della proteina e quindi non è in grado di associarsi con altre molecole di proteina e quindi non precipita. Quando si supera una certa forza ionica, si vede che la solubilità della proteina diminuisce. Aumentando una certa concentrazione di sale, si verifica salting out, cioè la proteina esce dalla soluzione e precipita. Si pensa che il sale riduca la quantità di acqua che ricopre la proteina. Questo provoca una tendenza della proteina ad associarsi e quindi a precipitare.

Questi due processi sono molto comuni nella purificazione delle proteine perché sono economici, facili da svolgere, ma hanno anche caratteristiche empiriche.

Centrifugazione

Si basa sull'uso della forza centrifuga per separare delle componenti. La provetta, se viene messa a roteare vorticosamente, assume una forma orizzontale. R(t) è la distanza della particella dal centro di rotazione e questa distanza cambia nel tempo: più roteo la provetta, più il campione si sposterà verso il fondo della provetta.

La forza centrifuga è la forza che agisce sulla particella e la porta a spostarsi verso il fondo della provetta. G: campo centrifugo o accelerazioni di gravità. Centrifuga: al centro ci sono i rotori che ospitano le provette, c'è un motore regolabile come velocità.

Centrifugazione differenziale

Separazione in frazioni per centrifugate successive, aumentando gradualmente il campo centrifugato applicato. Se la centrifugazione dura a lungo, si ha diversa disposizione sul fondo della provetta delle particelle: le particelle più grandi cadono sul fondo.