Purificazione delle proteine e la loro caratterizzaizone

Purificazione delle proteine

Introduzione alle proteine (lez.1 - 14/09)

Le proteine sono polimeri di amminoacidi di lunghezza molto variabile, da poche decine a diverse centinaia o migliaia. Qualsiasi essere vivente ha la quasi totalità delle funzioni biologiche governate da proteine. Le informazioni per la costruzione delle proteine sono contenute nei geni, cioè nelle sequenze di DNA. Le funzioni sono innumerevoli, strutturali (per esempio la cheratina nella forma dei capelli, tubulina e actina per il citoscheletro e così via), poi funzione di contrazione, come actina e miosina, funzione di riserva, funzione enzimatica, di trasporto e di segnalazione, ma anche di difesa immunitaria tramite anticorpi.

Che cosa è un amminoacido

Un amminoacido è una molecola fatta da un gruppo amminico e un gruppo carbossilico legati a idrogeno R, un carbonio centrale detto "alfa" che porta un gruppo detto gruppo variabile, unica parte variabile dell'amminoacido, e in base al tipo di R avremo un tipo specifico di amminoacido. Inoltre, il C centrale è stereogenico.

Gli aminoacidi sono 20 e si raggruppano in famiglie a seconda delle loro caratteristiche chimiche. Abbiamo per esempio i gruppi R:

• Polari, per esempio gruppi ossidrili o amminici, come la serina o treonina, la cisteina ha un gruppo tiolico;
• Non polari, e non presentano questi gruppi, tiolici, alcolici o amminici, e sono la leucina, valina, glicina, alanina, isoleucina, e tutti quelli aromatici eccetto la tirosina;
• Carichi negativamente (acidi) e possiedono gruppi totalmente ionizzabili, e in forma ionizzata sono in forma anionica, per questo sono acidi, e sono acido aspartico e acido glutammico, e possiedono un gruppo carbossilato privo di un protone rimanendo carichi negativamente, acidi;
• Carichi positivamente (basici) e sono lisina, arginina e istidina, che possiedono un azoto protonabile che si comporta da base. Possiedono una carica netta positiva.

Gli amminoacidi naturali sono una ventina, e possiamo però dire che 8 dei 20 aminoacidi sono essenziali, ovvero il nostro corpo non riesce a sintetizzarli e deve prenderli dalla dieta tramite quindi 'alimentazione.

Altra cosa fondamentale, è che gli aminoacidi per la loro struttura, per il fatto di avere un C legato a 4 elementi diversi, è un C asimmetrico e può avere due stereoisomeri possedendo infatti attività chirale, e sono gli stereoisomeri L e D. Per convenzione lo stereoisomero L si rappresenta mettendo il NH₂ alla sinistra del C centrale e tutto il resto della molecola a destra. Possiamo dire che è verissimo che esistono tutti e due gli stereoisomeri per ogni molecola di amminoacido, ma possiamo dire che la natura ha selezionato per ogni amminoacido solo una configurazione per costruire le proteine, ovvero lo stereoisomero di tipo L, quelli di tipo D esistono chimicamente e possono essere sintetizzate, ma in natura non sono presenti. Le nostre proteine sono solo fatte di amminoacidi levogiri. Quindi va da sé che non solo gli amminoacidi sono molecole chirali, anche le proteine stesse sono chirali, presentando allora la tipica attività ottica.

Come si legano gli aminoacidi

Come si legano gli aminoacidi tra loro al fine di formare la catena polipeptidica? Si fa con interazione diretta tra un aa e l'altro, tramite una reazione detta reazione di condensazione che porta alla formazione di un legame peptidico. Per convenzione si dice che si forma tra un gruppo carbossilico di un aa, con il gruppo amminico dell'aa successivo nella sequenza. Quindi COOH e NH₂ si condensano liberando una molecola d'acqua formando il legame peptidico.

Tralasciando come le proteine vengono sintetizzate, ovvero con processo di trascrizione, traduzione, con il coinvolgimento di tutti i meccanismi necessari, vediamo adesso l'organizzazione delle proteine.

Organizzazione delle proteine

Queste hanno quattro livelli di organizzazione:

Primaria

Ci dice, non solo quali aa sono presenti a formare la proteina, ma ci dice anche la sequenza ordinata degli aminoacidi, quindi in che ordine sono legati, a partire dall'N iniziale per arrivare al COOH finale. È un'informazione fondamentale, perché ciascuna proteina ha la sua struttura primaria caratteristica, quindi il processo di comprensione di una proteina inizia proprio da qui, trovare l'ordine di aa. Questo ci fa avanzare delle ipotesi sulle proprietà chimiche della proteina, perché gli aa con cui è costituita sicuramente ci fa intuire le caratteristiche globali della molecola. Potremmo aprire una parentesi infinita che ci fa capire come la sequenza aa di ogni singola proteina sia il frutto di un processo evoluzionistico che abbia portato a identificare la sequenza migliore per esplicare quella funzione nel migliore dei modi, alla massima efficienza. In termini biologici la struttura primaria è codificata e decisa dal processo di trascrizione del DNA, organizzato in triplette di nucleotidi detti codoni. Possiamo fare un esempio molto semplice per capire l'importanza della sequenza primaria di una proteina. Per esempio lo notiamo nell'ambito delle mutazioni della sequenza aminoacidica di una proteina. Una di queste è quella mutazione che porta alla patologia dell'anemia falciforme. La mutazione è puntiforme, dove un acido glutammico in posizione 6 viene scambiato con una valina. Il cambiamento è drastico, cambiamo infatti un amminoacido acido, carico negativamente, con un amminoacido apolare, neutro. Quindi è il massimo della differenza tra due amminoacidi. Il risultato è che questa banale, all'apparenza, mutazione, causa un effetto drammatico sulla struttura tridimensionale della proteina, che assume la conformazione a falce, da cui anemia falciforme. Il danno è enorme, riversandosi in patologie del sistema cardiovascolare. È un solo piccolo esempio, ma ci sono tantissime patologie causate da una singola mutazione. Per esempio il danno è enorme se si ha una mutazione simile concettualmente a carico di una delle proteine regolatrici delle cellule e dei suoi processi replicativi.

Secondaria

Ci racconta come gli amminoacidi, organizzati con una struttura primaria specifica si organizzano, in sovrastrutture di tre tipi: alfa eliche, foglietto beta o "random coils" (morfologia non ben definita, né alfa né beta). L'alfa elica è un arrangiamento elicoidale in cui gli aa formano tra di loro dei legami di idrogeno ogni 4 aa della stessa catena. Il foglietto beta, invece sono due tratti (di due catene polipeptidiche o della stessa catena) attaccati tra di loro e si formano legami di idrogeno. Da notare che in un singolo polipeptide possiamo anche avere tutte e tre le strutture in concentrazioni più o meno vaste e diverse.

Terziaria

È il modo in cui le strutture secondarie appena viste, alfa eliche, foglietti beta, e random coils, si organizzano e interagiscono tra di loro nello spazio. Queste strutture secondarie quindi riempiono lo spazio tridimensionale e interagiscono tra loro. Quindi è quella che realmente possiamo considerare come struttura nativa. La maggior parte delle interazioni che abbiamo tra le strutture secondarie sono deboli (idrofobiche di van der Waals, ioniche), a meno che non sia il legame disolfuro, allora (covalenti). Anche qui, così come la struttura primaria era un "impronta digitale" della proteina, perché ogni proteina presenta una ben definita struttura terziaria. Ben definita non significa solo che le strutture secondarie sono rigide o fisse nello spazio, infatti ci sono anche proteine che assolvono alla loro funzione biologica solo se non c'è rigidità, per cui si parla di proteine intrinsecamente disordinate, per cui nella loro conformazione nativa non possiedono una struttura secondaria o terziaria, men che meno quaternaria, fissa o rigida, ma che proprio per questo possono svolgere la loro funzione biologica. Quindi abbiamo interazioni di van der Waals per esempio tra gruppi radicali che nella struttura primaria sono lontanissimi, ma che entrano a contatto con le strutture secondarie o terziaria. Lo stesso vale per le interazioni di tipo polare, come quelle a ponte di idrogeno dove c'è un idrogeno che, carico parzialmente positivamente interagisce debolmente con un ossigeno parzialmente negativo di un residuo, vicino nello spazio, ma magari lontano nella sequenza primaria amminoacidica. L'idrogeno è meno elettronegativo dell'ossigeno, quindi legame H—O è polarizzato, quindi l'ossigeno ha una parziale carica negativa e idrogeno positiva. Questo legame tiene la catena principale stabilizzata in un certo modo specifico. Oppure quando abbiamo gruppi carichi abbiamo dei legami ionici. In questo caso abbiamo residui carichi, tipo acidi e basici che interagiscono tra loro. E infine abbiamo un tipo di legame molto forte che viene detto ponte disolfuro che viene a essere generato dalla ossidazione tra due gruppi tiolici SH di due cisteine affacciate, che perdono quindi due protoni e due elettroni. Ma così come avviene la reazione di formazione del ponte disolfuro, e quindi il processo di ossidazione, in realtà è possibile anche la reazione inversa, ovvero la riduzione del ponte disolfuro per tornare a avere due cisteine, aggiungendo al legame due elettroni e due protoni. Per esempio nelle cheratine abbiamo un'abbondanza di ponti disolfuro e non è da sorprendersi perché è evidente che il ponte disolfuro conferisce stabilità e rigidità, per cui la cheratina infatti la troviamo nelle unghie, o nei capelli, appunto strutture solide.

Quaternaria

Risulta dall'interazione da più catene polipeptidiche che fanno parte della stessa proteina. Non tutte le proteine hanno struttura quaternaria in quanto, se queste sono semplicemente composte da una sola catena polipeptidica, non potranno evidentemente avere questo tipo di struttura. Un esempio di struttura quaternaria è la tripla elica del collagene, tre eliche che interagiscono in un modo estremamente rigoroso come vediamo in figura. Quindi per descrivere il collagene non è sufficiente parlare di struttura primaria, secondaria e terziaria, perché descrivono una sola catena, ma la molecola in sé è fatta da tre di queste catene. Oppure troviamo l'insulina e l'emoglobina. L'insulina per esempio è fatta da una catena alfa e una beta, è quindi un eterodimero con aa diversi. Quando tratterremo la purificazione di proteine sarà fondamentale sapere se una proteina ha una struttura quaternaria o meno.

Purificazione delle proteine (lez.2 - 17/09)

È importante fare una breve osservazione, ovvero che nel parlare ora della purificazione delle proteine, ci dobbiamo mettere nell'ottica che parliamo quasi sempre di proteine che sono state clonate in organismi eterologhi (per over-esprimerle), con tecniche di biologia molecolare applicata (es. proteina eucariota umana in un organismo procariota, come un batterio). Ricordiamo per esempio la possibilità di poter andare a far esprimere una proteina umana per esempio in una cellula di mammifero, quindi nettamente superiore in termini di specificità rispetto all'espressione in Coli ad esempio. E questo trova motivo nel fatto che ogni proteina assume la propria struttura nativa, quindi dà luogo al folding, per un ben determinato motivo, non viene assunto per caso, ma avviene in genere in modo enzimaticamente assistito, dagli chaperoni.

Quindi è bene ricordare nel processo di clonaggio, che è importante scegliere la giusta via, ancor prima di procedere all'isolamento e alla purificazione proteica, per poter poi avere risultati soddisfacenti. Infatti, se la proteina non assume le giuste forme, la proteina diventa non più funzionale. Quindi una proteina ha una funzione SE la sua forma nativa è corretta, in caso contrario perde la propria funzione biologica, oppure ne assume un'altra ma non funzionale.

Bisogna approcciarsi a una serie di domande, in primis cosa voglio farci con la proteina purificata e quale è il migliore materiale da usare. Ovviamente infatti in base a ciò che voglio farci non è necessario sempre lo stesso livello di purezza per esempio. Oggi esistono tre tecniche che usiamo per determinare la struttura di una proteina, una è la cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare e la microscopia elettronica. Per esempio nella risonanza magnetica ovviamente richiedo una modesta precisione di purificazione, ma neanche richiedo però troppa precisione e estrema definizione nella sua purificazione, cosa che invece viene chiaramente richiesta per la cristallografia a raggi X in cui se non si riesce ad avere una purificazione di efficienza quasi prossima al 100% sarà davvero difficile fare una corretta cristallografia. Il rischio è che se si sbaglia questo passaggio poi non riusciremo a fare anche allora processi successivi alla purificazione, e quindi sprecando tempo ma soprattutto soldi. Dopodiché ci interessa sicuramente capire che contaminanti vanno rimossi, abbiamo quindi solo proteine nel campione (es. abbiamo zuccheri, lipidi ecc...)? Poi ci interessa una purificazione su larga scala o basta una piccola quantità? E ovviamente sono domande che mi devo porre prima di fare la purificazione, solitamente per esempio se il mio scopo è di sequenziare una proteina, o fare studi di catalisi enzimatica, non è necessario andare a ottenere tantissima quantità di proteina, ne basta poca, ma se voglio usare tecniche di biologia strutturale (ottenere mRNA) devo ottenere tanta quantità di proteina e avere purificazione su vasta scala. Uguale è importante l'ambito delle risorse umane, quanto lavoro è necessario, quanti strumenti devo usare? E allora la parte economica è evidente che rientra in gran parte negli studi di laboratorio. Ma poi è importante anche avere un'idea chiara e diretta sulle proprietà chimico-fisiche delle proteine, per esempio il punto isoelettrico, la natura della proteina, la solubilità, stabilità ecc... Dobbiamo quindi trovare il giusto equilibrio tra tutto ciò.

Ora, quali saranno le metodiche, a livello di panoramica generale, di cui avremo bisogno per purificare e caratterizzare in seguito le proteine? Sostanzialmente ci avvarremo di 3-4 tecniche, tra cui la centrifugazione, i vari tipi di cromatografia (per esclusione molecolare, per affinità, a scambio ionico), avremo le tecniche di filtrazione e ultrafiltrazione, e poi le tecniche elettroforetiche. Ecco qua uno schema che le riassume:

Sempre prima di approcciarsi a un protocollo specifico dobbiamo avere presente una cosa fondamentale, la proteina che vogliamo purificare, è già stata purificata da qualcun altro? C'è già un protocollo per la sua estrazione, o siamo i primi al mondo a farlo? La logica fa pensare che se c'è già qualcun altro che ha già pubblicato il come purificare questa proteina, abbiamo il lavoro già fatto, basta seguire passo passo questo lavoro. Sicuramente però è molto più avvincente a volte lavorare su proteine nuove, su cui nessuno ha mai messo mano. Allora dobbiamo cercare di essere noi a fare il protocollo di purificazione, e quindi dobbiamo essere in grado di standardizzare il protocollo, renderlo quindi riproducibile sia da noi stessi in un secondo momento, che da terzi. Una delle cose fondamentali è di ridurre il numero di step il più possibile, perché più manipolazioni facciamo del campione, e più perdiamo il materiale proteico, e non è il caso, partendo infatti quasi sempre da un materiale già di per sé limitato. Ma non solo, se di questa proteina vogliamo fare saggi biologici o vari studi strutturali, la proteina deve mantenere la struttura nativa, non possiamo permettere che si denaturi, a meno che non vogliamo occuparci del sequenziamento, per cui non ci interessa in fin dei conti il mantenimento della funzione della proteina. Prima di iniziare una purificazione abbiamo una marea di proteine, a diversi pesi molecolari, per cui abbiamo davvero tantissime proteine. Per cui noteremo che dovremo applicare via via più step purificativi in sequenza che vanno a rimuovere il rumore e l'inquinamento in eccesso. Per cui arriveremo all'ultimo step di purificazione che porta a avere un campione, sicuramente in parte non pura al 100% (non sempre ovviamente), ma che chiaramente rispetto all'inizio sarà enormemente più pura. Vediamo nella figura sotto un esempio, in cui vogliamo arrivare a purificare una proteina, una GGT1, a partire dal composto iniziale "iper-contaminato".

Quindi, riparliamo ancora degli usuali passi di purificazione, per esempio partiamo dall'omogeneato, di cui abbiamo per esempio 1L (numeri in riferimento a un'immagine esemplificativa non importante, alla slide numero 7) di campione iniziale, in cui c'è un sacco di proteine, decine di grammi di proteine totali. Via via ogni step porta a dare una diminuzione netta sia di volume totale della soluzione, sia la massa delle proteine totali. Infatti partiamo da circa 10.000 mg di proteina, finendo addirittura a 3 mg di proteina in un volume totale di soluzione addirittura a solo 6 ml (partendo da 1L). Quindi, se all'inizio la nostra proteina era una minoranza su tutta la soluzione, alla fine non solo l'avrò più pura, ma addirittura l'avrò anche arricchita, ovvero l'avrò de-contaminata dagli inquinanti.

Il grafico accanto ci fa capire come, per esempio, se volessimo purificare una proteina tramite 4 step di purificazione, e in ciascuno perdessimo il 25% delle nostre proteine, dopo 4 step avremmo solo il 31-32% delle nostre proteine, quindi sicuramente già fermarsi a uno step in meno o due in meno, se in fin dei conti la purezza non cambia troppo potremmo fare una strategia con base sulla convenienza.