Purificazione delle proteine

Purificazione delle proteine

Cap.1 - Introduzione

La purificazione delle proteine è un processo nel quale una miscela di vari analiti proteici a₁, a₂, a₃, a₄, … a_n vengono separati tramite appositi metodi chimico-fisici. Lo scopo è quello di isolare una proteina i-esima ed estrarla per studiarne le sue proprietà (peso molecolare, pI, conformazioni spaziali, termo-resistenza, concentrazione in sito biologico, ecc.).

Il processo può essere estremamente complesso, sia nell’estrarre la proteina dal tessuto, sia nel separarla e purificarla. Il processo può portare a percentuali considerevoli di perdita di campione. Anche considerando una resa dell’85% per ogni estrazione, dopo 4 cicli si è persa la metà del campione proteico. Se la nostra resa è del 75%, dopo quattro passaggi ci rimarrà solo il 32% del campione:

n_cicli(campione) = resa⁴(0,85) = 0,52

resa⁴(0,75) = 0,32

Le proteine

Le proteine sono le macromolecole maggiormente diffuse nell’organismo umano e animale. Svolgono molteplici funzioni biologiche, come quelle strutturali, di segnale, di catalisi e ormonali.

Una grandissima parte delle proteine conosciute sono costituite solamente da lunghe catene di polipeptidi (lunghe catene di amminoacidi uniti fra di loro); tali proteine vengono definite semplici. Se una proteina è costituita da altri tipi di molecole oltre agli amminoacidi (definiti come gruppi prostetici), sarà denominata in funzione del tipo di molecola con cui è coniugata:

• Proteina + Lipide = Lipoproteina
• Proteina + Glucide = Glicoproteina
• Proteina + Metallo = Metalloproteina

Vediamo adesso in dettaglio cosa è un amminoacido. La struttura molecolare di questa particolare molecola è costituita da un carbonio centrale legato ad un gruppo amminico (C – NH₂), un gruppo carbossilico (C – COOH), un idrogeno (C – H) e un gruppo funzione (C – R). La chimica del gruppo R determina il tipo di amminoacido (polare, apolare, basico o acido) e la sua chiralità. Noi ci interesseremo dei 20 (21 secondo recenti studi) amminoacidi proteinogenici, ovvero di quei amminoacidi che compongono le proteine. In natura, ad eccezione della glicina (Gly), tutti gli altri 19 amminoacidi sono chirali, nella forma levogira (L).

Non elencheremo tutti e 20 gli amminoacidi, ma per il momento ne citeremo altri due, per la loro importanza nei metodi di purificazione. Per prima abbiamo la L-Cisteina (L-Cys), una proteina contenente un atomo di zolfo:

• L-Cisteina

Questo amminoacido può dimerizzare tramite ponti di bisolfuro (R – S – S – R’) formando cistina: (Ponte bisolfuro della cistina, lunghezza 2,05 Å).

Un’altra proteina di particolare interesse è la L-Istidina (L-His), una proteina che nel gruppo R presenta un anello di imidazolo, che può formare, tramite i doppietti liberi dell’azoto, complessi con metalli a doppia carica:

• L-Istidina (si noti l’anello di imidazolo)

Il legame peptidico

Gli amminoacidi possono unirsi fra loro tramite condensazione grazie a particolari enzimi. La reazione di condensazione forma un legame peptidico, un legame molto stabile, che permette la creazione della struttura della proteina. La stabilità è accentuata dalla delocalizzazione del legame (Tautomeria ammina-immina).

La struttura delle proteine

La struttura e conformazione delle proteine è essenziale per comprendere la strategia da adottare per purificarle e separarle. Proteine completamente denaturate avranno infatti perso la loro funzione biologica e non potremmo certo sfruttare la loro affinità per un particolare substrato per poterle separare da altre. Una breve carrellata delle quattro possibili strutture sarà qui presentata:

• Struttura primaria: La struttura primaria delle proteine consiste in una lunga catena di n residui amminoacidici, disposti come una catenina di perle.
• Struttura secondaria: Questo tipo di struttura è in 2D; gli amminoacidi sono avvolti su se stessi, formando dei particolari motivi. Due sono le principali conformazioni nella struttura secondaria: elica α e foglietto β. La struttura ad elica è termodinamicamente più stabile della struttura a foglietto.
• Struttura terziaria: La struttura terziaria ha conformazioni in tutti e tre gli assi (x, y, z). Questa conformazione è retta anche da ponti bisolfuro e da interazioni di Van Der Waals. È la struttura terziaria a permettere il funzionamento biologico di una proteina. Questa struttura è estremamente sensibile al calore (almeno ciò vale per la stragrande maggioranza delle proteine) e un’eccessiva energia termica del sistema può denaturarla irrimediabilmente.
• Struttura quaternaria: Quest’ultima struttura è un oligomero di più strutture terziarie (subunità). Un ottimo esempio è il tetramero l’Emoglobina (Hb), costituita da due subunità alpha (141 residui) e due subunità beta (146 residui).

Dimensioni delle proteine

Le dimensioni delle proteine possono variare enormemente. Abbiamo proteine umane formate da poche centinaia di residui amminoacidici come il Citocromo c e macromolecole enormi come la Titina:

La marcata differenza di peso fra il Citocromo c e l’Emoglobina o fra l’Apolipoproteina B e la Titina può essere sfruttata per separarle da una miscela proteica.

Cap.2 - Metodi di estrazione

L’estrazione della proteina dal tessuto richiede la citolisi dei suoi componenti cellulari. Vi possono essere diversi metodi, come la rottura per via fisica, per sonicazione o per osmosi. Nell’osmosi si immerge una cellula in una soluzione strettamente ipotonica, la cellula per compensare la drastica differenza di concentrazione salina assorbe acqua dentro di sé, esplodendo per l’eccessiva quantità assorbita.

Nella sonicazione si usano particolari vibrazioni dei liquidi (ultrasuoni) per rompere le membrane cellulari. Anche la via criogenica è un modo utile, cristallizzando l’acqua dove sono in soluzione le proteine che si andranno a rompere per la dilatazione del volume dell’acqua.

Tampone di estrazione

Il tampone di estrazione è necessario per avere la nostra proteina in condizioni ottimali. Il tampone deve avere una bassa temperatura, attorno ai 4º C; generalmente è composto da questi reattivi:

• Soluzione salina con 0,1-0,2 M di forza ionica
• Agenti riducenti (ad esempio il glutatione ridotto)
• Inibitori della proteasi (la proteasi è un catalizzatore della rottura del legame peptidico)
• EDTA (per chetare ioni metallici bivalenti come Mg²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺)
• Azoturo di sodio (NaN₃, un agente batteriostatico)

Cap.3 - Metodi di purificazione a bassa risoluzione

Salamoia (salting out)

Un metodo poco costoso per separare una miscela di proteine in una soluzione acquosa è la salamoia (tecnica meglio conosciuta come salting out). Nella miscela viene disciolto, in concentrazioni sempre maggiori, un sale, generalmente il (NH₄)₂SO₄, ad alta forza ionica (2 o più cariche). La forza ionica del sale depaupera la superficie delle proteine dalle molecole di H₂O, massimizzando le interazioni fra le proteine stesse, formando grandi agglomerati proteici che precipitano.

Precipitazione per pH

Per far precipitare le proteine si può anche sfruttare la concentrazione degli ioni H⁺. L’elevata concentrazione di ioni idrogeno modifica la costante dielettrica dell’acqua (l’acqua pura ha una costante di 80 a 20º C), favorendo le interazioni fra le proteine che si agglomereranno portando a precipitazione. Inoltre, la carica netta delle proteine ne sarà a sua volta influenzata da questa concentrazione di ioni idrogeno:

• pI = pH = proteina globalmente neutra
• pI < pH = proteina carica positivamente
• pI > pH = proteina carica negativamente

Se il pI è uguale al pH la proteina avrà egual numero di gruppi carbossilici deprotonati e gruppi amminici protonati. Se il pI è minore del pH, la proteina tenderà ad avere più gruppi amminici protonati (carica positiva). Se il pI è maggiore del pH, la proteina tenderà ad avere più gruppi carbossilici deprotonati (carica negativa). L’influenza del pH sulla carica netta delle proteine sarà una proprietà chimico-fisica che sfrutteremo successivamente su altri metodi di separazione.

Precipitazione per solventi organici

Alcuni solventi organici, come l’alcool etilico (C₂H₅OH), sono ottimi agenti precipitanti per le proteine. Normalmente vengono aggiunti alla soluzione a temperature attorno ai –20º C, per evitare denaturazione della proteina. Non tutti i solventi organici sono agenti precipitanti, la N,N-dimetilformammide è un ottimo solvente delle proteine.

Precipitazione termica

La maggior parte delle proteine animali e umane ha un optimum di funzionalità attorno ai 36º/37º C. Già verso i 45º C la funzionalità è compromessa, mentre la struttura tende a collassare, riducendo la proteina a filamento. Vi sono però alcuni organismi che presentano proteine termo-resistenti, anche sui 90º C; per le caseine del latte occorre portare la soluzione a 140º C. Una miscela di proteine, contenenti anche quest’ultime, se fatta riscaldare a 50º / 70º C presenterà... (continua)