Microbiologia: virologia

Virologia

Cenni storici

I virus erano già presenti prima di Cristo. La prima testimonianza scritta di infezione virale è un geroglifico che ritrae un sacerdote con i tipici segni di una poliomielite paralitica. La prima definizione si ha nel 1892 da Dimitri Ivanowski, il quale dimostrò che estratti di foglie di tabacco malate, passati attraverso un filtro di ceramica in grado di trattenere i batteri, potevano ancora trasmettere la malattia ad altre piante. Successivamente, nel 1898, un altro scienziato, Beijerinick, confermò i risultati e sviluppò per primo il concetto di virus (veleno) come agente filtrabile infettante.

NB. I virus sono agenti non solo piccoli, ma si replicano solo nell’ospite e non nel brodo di coltura. Il primo virus capace di infettare l’uomo fu quello della febbre gialla scoperto da Reed nel 1901. Nel 1915 furono scoperti i batteriofagi, cioè virus che vanno ad infettare le cellule batteriche e hanno importanza dal punto di vista genetico. Nel 1933 si scoprì il virus influenzale. La scoperta più grossa fu fatta nel 1950, quando furono scoperte colture cellulari dove i virus potevano essere cresciuti e quindi si poteva studiarli in maniera dettagliata e approfondita.

I virus sono gli organismi viventi più abbondanti sul pianeta. Studi di metagenomica di campioni ambientali amplificati e sequenziati mostrano che i geni virali costituiscono la maggior parte della geosfera. I virus hanno un’importanza non diversa dai batteri, sull’evoluzione e anche sull’origine del DNA e dei mammiferi. Probabilmente sono nati prima dei batteri e degli eucarioti, e sembra che i virus a RNA siano stati presenti prima dei virus a DNA. Infatti, l’RNA oltre ad avere una capacità catalizzante (ribozima) aveva anche quella di acido nucleico, per cui si sospetta che sia nato prima l’RNA del DNA.

I virus sono organismi viventi parassiti endocellulari obbligati perché crescono esclusivamente all’interno delle cellule (per esempio non come invece crescono sull’agar fanno i batteri). Il genoma virale è costituito o da RNA o da DNA ed è molto piccolo, per cui deve sfruttare molecole a livello cellulare. Mentre la cellula batterica si divide per scissione binaria, nel caso del virus, se questo infetta una cellula, dà origine a migliaia di virus. La progenie virale, i virioni, rappresenta il veicolo di trasmissione del genoma virale nelle cellule adiacenti, avviando un nuovo ciclo infettivo. I virus possono infettare moltissimi esseri viventi di regni diversi: mammiferi, uccelli, anfibi, rettili, pesci, piante, funghi, insetti e batteri.

Per vedere la morfologia dei virus siamo costretti ad usare il microscopio elettronico, avendo questi la dimensione del nanometro. I genomi virali variano in lunghezza da 3500bp fino a circa 280000bp.

Struttura

Ci sono diversi tipi di struttura:

• Elicoidale/tubulare: Alcuni virus hanno una morfologia di tipo elicoidale/tubulare con l'acido nucleico a spirale in stretto contatto col tubulo e le proteine avvolgono e proteggono il genoma virale prendendo il nome di capside, di cui ogni subunità proteica prende il nome di capsomero. L’acido nucleico deve essere protetto esternamente perché nell’ambiente andrebbe facilmente incontro a degradazione. Questa struttura è, per esempio, tipica del virus del mosaico del tabacco, oppure del virus della rabbia.
• Icosaedrica: Altri (ad esempio Adenovirus), hanno una struttura icosaedrica. L’icosaedro è un poliedro fatto da 20 facce triangolari. Nel caso di questa figura si vedono fibre proteiche partire da vertici che servono per la recettorialità.
• Esometrica: La forma esometrica è tipica del virus influenzale, al suo interno c’è il genoma associato alle proteine che lo proteggono. Ha una struttura lipoproteica all’esterno del capside che è arricchita da lipoproteine (spicole) virus-specifiche.
• Batteriofago T4: Il batteriofago T4 è formato da una testa, da un collare, da una coda e da una piattaforma, tutte di natura proteica. Nella testa c’è il genoma del batteriofago e, quando il batteriofago aderisce con la piastra di adesione alla parete batterica, le proteine della coda che sono contrattili si accorciano facendo avvicinare la testa al batterio e questa inserisce il genoma all’interno del batterio come una siringa.

Esiste una classificazione dei virus che si basa su:

• Natura del genoma (se è RNA o DNA)
• Simmetria del capside (icosaedrica, etc)
• Presenza o meno di pericapside/envelope, quella struttura lipoproteica all’esterno del capside. I virus nudi hanno solo capside e genoma
• Dimensione del virione

Classificazione gerarchica

• Ordine
• Famiglia → indicato dal suffisso viridae
• Sottofamiglia
• Genere → indicato dal suffisso virus
• Specie
• Ceppo

Componenti virali

• Proteine strutturali (es. capside)
• Proteine di membrana (es. envelope)
• Enzimi → proteine non strutturali, sono per lo più ad attività enzimatica
• DNA o RNA

L’envelope, presente solo in alcuni virus, deriva dalla cellula ospite. Alcune famiglie ottengono il pericapside dalla membrana plasmatica, altre dalla membrana nucleare e altre ancora dalla membrana del Golgi.

Capside

La sua funzione principale è quella di proteggere il genoma dall’ambiente esterno e dalle nucleasi. Inoltre, riconosce i recettori e trasporta il genoma al nucleo. Per una questione di strategia politica del risparmio energetico del genoma virale, le proteine che sono espresse dal virus sono spesso delle subunità proteiche ripetute. Questo perché il genoma è limitato. Le forze che legano insieme i protomeri sono idrostatiche (sicuramente non covalenti). I virioni sono dati dall’interazione proteina-proteina, proteina-lipidi, proteina-acido nucleico. Inoltre, poiché l’acido nucleico è tendenzialmente di carica negativa, le proteine che la circondano esporranno per lo più gli amminoacidi a carica positiva.

Assemblaggio dei capsidi elicoidali: vengono prodotti monomeri proteici che si assemblano a disco il cui foro presenterà all’interno il genoma. Via via vengono assemblati i vari dischi fino a lasciare liberi gli estremi 3’ e 5’ da una parte. Tra questi virus troviamo il TMV (virus del mosaico del tabacco) e il virus della rabbia.

Capsidi icosaedrici: l’adenovirus presenta i capsomeri associati fra loro in maniera molto stretta e si associano a 5 unità ai vertici dell’icosaedro prendendo il nome di pentoni, mentre i capsomeri che vanno a ricoprire la faccia triangolare sono disposti a 6 protomeri e vengono chiamati esoni. L’icosaedro, a seconda di dove viene osservato, ha diversi assi di simmetria: nel caso in cui si guarda il lato di un triangolo ci sono 2 assi, nel centro di un triangolo 3 assi e al vertice 5 assi di simmetria. Esiste un calcolo matematico chiamato calcolo della triangolazione (T) utile per calcolare il numero di subunità presenti sulla superficie triangolare di un icosaedro, quindi calcolare quanti capsomeri ha un virus. Per esempio l’adenovirus ha T=25 e il calcolo che si fa è:

N= (10xT) +2

N= (10x25) +2 = 252

Questo conto è stato fatto per vedere come fanno i virus a mantenere lo stesso numero di proteine anche quando aumenta la loro struttura: suddividono la faccia triangolare in tot strutture occupate da un maggior numero di proteine. Per esempio nel poliovirus ci sono 3 unità strutturali su una faccia e quindi T=3.

I poxvirus rappresentano gli unici virus con struttura complessa: c’è un nucleocapside che presenta una membrana interna e una esterna e sulla superficie più esterna ci sono proteine.

Proteine non strutturali

Le proteine che possono ottenere i virus e che non sono strutturali sono gli enzimi. Ci sono enzimi che intervengono nell’interazione virus-cellula ospite, come la neuraminidasi (tipica del virus influenzale) che si ritrova sull’envelope del virus. Altri enzimi sono necessari per la trascrizione del genoma virale. Principalmente abbiamo RNA polimerasi RNA dipendente, ma anche RNA polimerasi DNA dipendente e trascrittasi inversa. Le proteine kinasi hanno notevole importanza nella fase di replicazione virale.

Genoma virale: proprietà

• DNA o RNA, singola o doppia elica, lineare o circolare, unico o frammentato
• Strettamente impacchettato nel capside
• Associato a ioni positivi o a proteine basiche (virali o cellulari) per neutralizzare le cariche negative dei gruppi fosfato
• Ha sequenze di riconoscimento per il packaging nella struttura primaria e secondaria, cioè sequenze riconosciute da proteine self (virali)
• Ha sequenze di innesco per la replicazione
• Può avere geni sovrapposti
• Può subire splicing
• Il virus con genoma a RNA può avere polarità positiva o negativa

Le caratteristiche del genoma virale definiscono le diverse strategie di replicazione.

Classificazione di Baltimore

Divide i virus in classi replicative, così da poter ricordare e vedere meglio come questi virus si possono replicare.

Virus a DNA: si va a vedere la simmetria del capside (tutti icosaedrici tranne i poxvirus), la presenza o no del pericapside, l’architettura del genoma (tutti sono ds tranne la famiglia parvoviridae che è ss DNA). I poxvirus sono gli unici che hanno una RNA polimerasi DNA dipendente e quindi possono replicare nel citoplasma perché il virus possiede la sua polimerasi, mentre tutti gli altri non ce l’hanno e hanno bisogno di quella cellulare per cui si replicano nel nucleo.

Virus a RNA: anche qui si va a vedere la simmetria, la presenza o meno del pericapside (nudi sono meno rispetto agli enveloped), l’architettura del genoma (tutti ss RNA tranne la famiglia reoviridae che ha ds RNA). Alcune famiglie hanno il genoma frammentato e sono orthomyxoviridae (virus influenzale), bunyaviridae, arenaviridae e anche i reoviridae.

Fasi di replica virale

• Adsorbimento: è la prima fase in cui il virus si attacca e riconosce recettori specifici sul target cellulare
• Penetrazione: è la seconda fase, quando il virus penetra all’interno della cellula
• Uncoating: momento in cui il genoma si libera dall’involucro capsidico
• Trascrizione, traduzione e replicazione del genoma
• Assemblaggio: fase in cui il genoma della progenie virale si unisce alle proteine del capside per formare i virioni
• Rilascio: quando la cellula libera tantissime particelle virali

NB. Il tropismo cellulare indica quali sono le cellule che presentano recettori specifici per quel virus (spettro d’ospite). Per esempio il virus dell’HIV si attacca al recettore CD4 presente su certe cellule; il virus Epstein-Barr (della mononucleosi) ha i recettori CD21 sui linfociti B. Alcuni recettori sono comuni, come CAR sia per adenovirus che per picornaviridae. La prima fase può avvenire anche a 4°C, mentre la penetrazione richiede una temperatura di 36-37°C (quella corporea). I meccanismi di penetrazione sono diversi:

• I virus con pericapside (es. HIV e HSV) penetrano tramite fusione con la membrana plasmatica con conseguente liberazione del nucleocapside. L’HIV presenta delle proteine di membrana importanti (gp120 e gp41) che si legano al recettore specifico CD4 (nei linfociti T); questo legame non è sufficiente, c’è bisogno di agganciarsi ad un co-recettore (CCR5). Quando la gp120 si è legata al recettore e al co-recettore cambia conformazione, aprendosi e facilitando l’aggancio della proteina gp41 alla membrana plasmatica che favorisce il rilascio del nucleocapside nella cellula (proteina di fusione).
• Gli orthomyxovirus (es. virus influenza) presentano pericapside, ma penetrano per endocitosi e la fusione avviene poi con la membrana dell’endosoma. Il virus entra nell’endosoma che si carica di idrogenioni grazie ad una pompa ionica; il pH acido facilita il cambiamento conformazionale delle proteine dell’envelope liberando le riboproteine (genoma associato alle proteine).
• I picornavirus sono nudi, quindi privi di pericapside e penetrano con endocitosi entrando attraverso l’endosoma. Es. poliovirus, quando il virus entra nell’endosoma avviene un cambiamento conformazionale delle proteine del capside. Si apre una specie di poro tra queste proteine strutturali che facilita la liberazione dell’acido nucleico all’interno della cellula.

Pericapside

Struttura non fondamentale che si trova all’esterno del capside ed è arricchito da proteine spesso con funzione recettoriale (es. gp120 e gp41 per HIV). È tipico dei virus animali. Deriva dalle membrane della cellula ospite per mezzo di un processo di gemmazione, è quindi formato dai fosfolipidi tipici della membrana plasmatica più proteine specifiche (citate sopra). Le glicoproteine che formeranno le spicole sono codificate dal virus. Queste strutture sono importanti nella fase di attacco del ciclo replicativo virale.

Rilascio dei virioni dalla cellula

I virus nudi escono dalla cellula per lisi cellulare, mentre i virus provvisti di pericapside escono per gemmazione e ottengono il pericapside proprio dalla membrana plasmatica a cui vengono aggiunte le proteine virali.

Batteriofagi

Possono avere un ciclo litico o un ciclo lisogeno:

• Il ciclo litico è quello in cui il batteriofago riesce a lisare la cellula batterica e la progenie virale fuoriesce dal batterio. Si parla di fago virulento.
• Il ciclo lisogeno viene effettuato da un fago temperato che può stare nella cellula batterica in uno stato silente finché non si sveglia e dà inizio ad un ciclo litico. Succede che il DNA fagico si integra con il genoma cellulare e viene espressa una proteina fagica che previene la trascrizione di altri geni fagici, cioè di quei geni che avviano il ciclo litico. Quando la cellula batterica si divide, questo genoma profagico viene trasmesso. In risposta a segnali ambientali (o chimici se in laboratorio) il genoma fagico si risveglia e può dare inizio ad un ciclo litico.

Lisogenia

I fagi temperati producono il fenomeno di lisogenia, oppure lisano la cellula batterica come i fagi virulenti. Il fenomeno di lisogenia fu inizialmente identificato in colture batteriche che, pur contenendo basse quantità di fagi infettivi, non andavano incontro a lisi. Consiste nella capacità del DNA di alcuni fagi di integrarsi nel genoma del batterio e persistere indefinitamente senza essere trascritto. Il DNA del fago lisogenico, all’interno della cellula (integrato o meno) viene detto profago e:

• Si può integrare in posizioni a caso o in posizioni ben precise del cromosoma
• Si integra per crossing-over fra il genoma fagico circolarizzato e il genoma dell’ospite
• Si può escindere dopo induzione e andare incontro a ciclo litico
• È molto importate perché può portare ad un cambiamento fenotipico del batterio

La produzione della proteina difterica, che causa la difterite, non avverrebbe se il batterio non fosse infettato. La scarlattina è causata dallo streptococcus pyogenes, ma è dovuta ad una tossina fagica botulinica. La trasduzione è quel processo per cui il batteriofago inserisce il proprio genoma nel genoma batterico. La conversione fagica è il nome del processo infettivo che comporta effetti sul fenotipo del batterio, come la secrezione di tossine (difteritica, eritrogenica, botulinica).

Meccanismi per massimizzare la capacità codificante

Come riesce il virus a codificare diverse proteine a partire da un genoma così piccolo? I meccanismi sono:

• Poliproteine: alcuni virus riescono a codificare con il proprio genoma un’unica poliproteina che viene successivamente divisa dalle proteasi in proteine strutturali (del capside e pericapside) e non strutturali (ad attività enzimatica + emagglutinina e neuraminidasi che stanno sulla superficie del virus influenzale).
• Leaky scanning: se abbiamo un RNA virale è possibile che nella sua sequenza ha un AUG iniziale (corrisponde al primo aminoacido, la metionina) e, dopo una sequenza di lunghezza variabile, un altro AUG; quindi il virus, per codificare la proteina, può produrre due proteine diverse a seconda dell’AUG da cui parte la traduzione.
• Re-iniziazione: ci sono dei genomi che sono dei raggruppamenti di geni messi uno dietro l’altro con una piccola sequenza intermedia tra l’uno e l’altro, ognuno ha un AUG iniziale e termina con un codone di stop (es. UAA); ci sono quindi diversi mRNA.
• Nonsense suppression: in alcuni casi, il virus presenta una sequenza che può corrispondere ad un tRNA nonsenso. Per meccanismi intrinseci della sequenza genica, ad un certo punto una tripletta viene riconosciuta come nonsenso e vengono prodotte due proteine diverse.
• Frameshifting: a seconda del modulo di lettura dell’RNA messaggero, se partendo dall’AUG codifica e legge tutte le basi dà origine ad una certa proteina, ma se salta una base determina un’altra proteina. Questa cosa non è casuale, ma è un meccanismo virale ben regolato.

Replica virale

Il Genoma virale: codifica per la sintesi delle componenti virali e degli enzimi della replicazione. È costituito da una molecola di DNA o RNA singola o multipla, segmentata, circolare o lineare. Può essere a singolo filamento (ss) o a doppio filamento (ds). L’mRNA virale si lega ai ribosomi della cellula ospite e viene tradotto in proteine virali.