Microbiologia e virologia generale

Microbiologia e virologia generale

Differenze tra cellula procariotica ed eucariotica

La cellula procariotica possiede un genoma (batterico o plasmide) non racchiuso dal nucleo ma libero nel citoplasma in una zona specifica chiamata nucleoide. I batteri sono costituiti da una capsula, una parete cellulare e una membrana plasmatica. È presente un flagello come strumento motorio, mentre pili e fimbrie sono importanti al fine di ancorarsi alle cellule da infettare. Gli unici organuli intracellulari sono i ribosomi.

La cellula eucariotica invece ha un nucleo, possiede delle strutture molto complesse che invece non possiede la cellula procariotica.

Cellula procariote

Membrana cellulare

È formata da un doppio strato fosfolipidico con proteine (mosaico fluido), non possiede steroli ma contiene gli opanoidi. Ha la funzione di regolare il passaggio di sostanze, è sede dei mesosomi (invaginazioni della membrana con diverse funzioni). Nei cianobatteri, enzimi e pigmenti sono contenuti in ripiegamenti della membrana citoplasmatica che si approfondano nel citoplasma, detti cromatofori e tilacoidi.

Parete cellulare

La parete cellulare ha funzione protettiva contro la pressione osmotica qualora la cellula si trovi in ambiente non isosmotico e per mantenere la pressione di turgore. Presente nelle cellule vegetali e formata da cellulosa, negli archeobatteri e nei batteri è formata da peptidoglicano. Il peptidoglicano (o mureina), oltre ad essere il componente principale della parete, costituisce il principale responsabile della rigidità della cellula ed è costituito da una ripetizione di lamine composte in prevalenza da N-acetilglucosammina, acido N-acetilmuramico e un piccolo gruppo di proteine.

Esternamente alla parete cellulare ci può essere uno strato più spesso e meno rigido, detto capsula. Alcuni batteri possono incominciare a produrre la capsula anche se inizialmente ne erano privi.

Esempi di organismi formati da cellule procariote (tutti unicellulari) sono: i batteri, le alghe azzurre e gli archeobatteri.

Struttura: Presente in tutti i batteri ad eccezione dei micoplasmi e di alcuni archebatteri. I micoplasmi sono degli organismi patogeni tra un batterio ed un virus. Le funzioni della parte batterica sono: determina la forma del batterio, responsabile del comportamento al Gram, sede delle caratteristiche dell’antigene, dona sensibilità agli agenti esterni, è un punto di ancoraggio di virus batteriofagi, protegge nei confronti della lisi e infine è anche un punto di ancoraggio per gli antibiotici.

Colorazione di Gram

Questa divide due grandi gruppi di batteri in relazione alla diversa composizione della parete cellulare:

• Gram positivi (blu/violetto): parete più spessa a più strati, contenente acidi teicoici, aminoacidi, mono- e polisaccaridi;
• Gram negativi (rosso): parete più sottile collocata fra la membrana esterna e quella citoplasmatica, gli acidi teicoici sono assenti.

Gram+

• Nei batteri Gram+ la membrana citoplasmatica è protetta da una spessa parete: numerosi strati di peptidoglicano attraverso il quale passano polimeri di alcoli come gli acidi teicoici. Sono altamente antigenici e quindi donano specificità antigenica (polisaccaride A di Staphylococcus aureus e carboidrato D di Enterococcus faecalis);
• Struttura altamente polare e si oppone al passaggio di molecole idrofobiche che potrebbero danneggiare la membrana;
• Permeabile alle molecole idrofile (aa e zuccheri);
• La parete permette di sopravvivere in ambiente ipotonico, impedendo l’assunzione di acqua dall’esterno evitando la lisi cellulare;
• La parete è quindi alla base della specificità Gram+: cristal violetto e il lugol passano la parete poiché idrofile mentre il complesso colorante + lugol all’interno della cellula diventa idrofobico impedendogli di tornare indietro anche in presenza di solventi.

Gram-

• Parete cellulare formata da peptidoglicano molto più sottile dei Gram+, quindi non in grado di contrastare il passaggio di molecole idrofobiche che potrebbero anche danneggiare la membrana;
• Per risolvere il problema i Gram- presentano una seconda membrana plasmatica esterna che avvolge il batterio all’esterno della parete. Si tratta di una membrana particolare costituita internamente dai fosfolipidi ed esternamente da una molecola LPS, quindi lipopolisaccaride di superficie. Questa dona un’azione endotossica del batterio;
• 3 componenti principali: il lipide A, due zuccheri come l’acido chetodeossioctonico (KDO) e l’eptoso, e l’antigene O. L’insieme di questi 3 componenti impedisce il passaggio dei componenti idrofobici, non consente il passaggio delle molecole idrofile. Sono presenti nella membrana esterna dei canali per la diffusione passiva delle molecole idrofile come gli zuccheri e gli aa.

Comportamento alla colorazione

Gram+

• Disidratazione della parete cellulare con alcol;
• Riduzione permeabilità;
• Permane il primo colorante (violetto);
• Impossibile assorbire il secondo (rosso);
• Batteri colorati in blu/violetto.

Gram-

• Componente LPS solubilizzata dall’alcol;
• Aumenta permeabilità della membrana esterna;
• Eliminazione primo colorante (cristal violetto);
• Assorbimento del secondo colorante (di contrasto);
• Batteri colorati in rosso.

Forme batteriche

• Cocchi (cellule sferiche);
• Bacilli (cellule cilindriche più o meno allungate);
• Coccobacili (forme intermedie rispetto alle due precedenti);
• Vibrioni, spirilli, spirochete (forme ricurve);
• Diplococchi o diplobacilli (cocchi o bacilli disposti a coppie);
• Streptococchi o streptobacilli (cocchi o bacilli disposti in catene);
• Stafilococchi (cocchi disposti a grappolo);
• Tetradi (cocchi disporti a gruppi di quattro);
• Sarcine (cocchi disposti a gruppi di otto).

Movimento della cellula batterica

Alcune cellule batteriche posseggono la capacità di muoversi grazie alla presenza di flagelli:

• Monotrichi (possiedono un solo flagello, ad una estremità);
• Anfitrichi (possiedono due flagelli, alle due estremità);
• Lofotrichi (possiedono più flagelli da un’estremità a formare un ciuffo);
• Peritrichi (possiedono più flagelli sparsi su tutta la superficie).

Composizione del flagello

1. Il Filamento: forma elicoidale e fuoriesce dalla cellula;
2. Il Gancio: di forma tubolare che appunto lega il flagello alla cellula;
3. Il Corpo Basale: il corpo basale o cinetosoma è una struttura complessa differente nei Gram+ e nei Gram-, accomunata dalla presenza dell’anello MS immerso nella membrana citoplasmatica e complessato con proteine MOT (che permettono il moto grazie ad una forza protone-motrice) e proteine FLI (che invertono la rotazione dell’uncino).

Pili o fimbrie

• Sono molto più piccole dei flagelli;
• Non servono per il movimento della cellula ma per aderire meglio alle mucose/superfici;
• Sono costituite da proteine dette piline;
• Particolare tipo di pili sono quelli denominati F (fertilità) fondamentali nei processi di coniugazione.

Spore batteriche: protezione

• Alcuni organismi Gram+ (Bacillus e Clostridium) in particolari condizioni ambientali danno origine a strutture differenziate chiamate spore;
• Le spore batteriche sono endospore ossia originano all’interno della cellula madre (sporangio) e vengono liberate nell’ambiente esterno;
• Nel genere Bacillus la spora è più piccola del diametro della cellula madre, nel Clostridium è più grande;
• Latenza metabolica -> il DNA viene circondato da 3 strutture: Corteccia, Mantello (o rivestimento), Esosporio-Espulsione.

Spore di interesse clinico umano

• Clostridium botulinum: intossicazione alimentare, la germinazione della spora produce una tossina che impedisce il rilascio di acetil-colina con conseguenza di paralisi flaccida;
• Clostridium tetani: il tetano colpisce la terminazione del motoneurone con conseguente paralisi flaccida;
• Bacillus anthracis: Carbonchio colpisce l’apparato respiratorio (malattia del tosatore).

Cellula eucariotica

Un eucariote è un organismo costituito da una o più cellule che, per definizione e in contrapposizione con quelle procariotiche, hanno un nucleo ben differenziato che contiene la maggior parte del DNA cellulare, racchiuso da un involucro poroso formato da due membrane.

Strutture ed apparati

Membrana plasmatica

Struttura:

• Doppio strato fosfolipidico con annesse proteine e glucidi;
• Spessore di circa 7 nanometri.

Funzioni:

• Mantiene costante l’ambiente interno;
• Agisce come una membrana selettivamente permeabile;
• Modifica la sua forma a seconda delle esigenze della cellula;
• Fa entrare le sostanze utili e lascia uscire quelle di scarto.

Citoscheletro

All’interno della cellula è stata evidenziata la presenza di un fitto intreccio di fibre proteiche che danno forma alla cellula stessa e attacco agli organuli cellulari.

Le fibre che compongono questa struttura sono diverse tra loro:

• Microtubuli - strutture cave di diametro pari a circa 25 nm. Si diramano dalla zona del nucleo;
• Filamenti di actina - diametro fino a 7 nm, costituita da due filamenti attorcigliati tra loro. Sono disposti in fasci paralleli tra loro;
• Filamenti intermedi - formati da tre filamenti attorcigliati, costituiti da proteine fibrose resistenti. Formano fasci che garantiscono un rinforzo strutturale alla cellula.

Reticolo endoplasmatico liscio (REL)

• È costituito da un sistema di vescicole appiattite che consentono lo spostamento delle sostanze da una parte all’altra della cellula;
• È la sede della sintesi dei fosfolipidi e delle glicoproteine necessarie per la costruzione della membrana;
• Svolge un ruolo importante nel metabolismo del glucosio;
• Regola il movimento di ioni Ca²⁺ durante la contrazione muscolare (nelle cellule animali).

Reticolo endoplasmatico rugoso (RER)

• È rivestito di particelle sferoidali, i ribosomi. È in diretto collegamento con il reticolo endoplasmatico liscio e con la membrana nucleare. Dal reticolo endoplasmatico liscio si staccano delle vescicole di trasporto che raggiungeranno l'apparato di Golgi, al cui interno terminerà la costruzione della molecola proteica.

Ribosomi

• Questi organuli sono costituiti di RNA e proteine e hanno la funzione di sintetizzare le nuove proteine. Il loro numero nella cellula varia da qualche migliaio nei procarioti fino a qualche milione negli eucarioti. Possiamo trovare ribosomi sia legati alle membrane del reticolo che liberi nel citoplasma.
• I ribosomi dei procarioti presentano alcune differenze nella struttura e nella composizione rispetto a quelli delle cellule eucariote; questo fatto rende possibili trattamenti con antibiotici che aggrediscano solo i ribosomi batterici interrompendo il metabolismo di questi patogeni, senza danneggiare i ribosomi del paziente.

Apparato di Golgi

• Costituito da lamelle e cisterne sovrapposte, in cui si accumulano e vengono ulteriormente lavorate le sostanze prodotte in altre zone del citoplasma. Al suo interno vengono costruite molecole complesse, quali le glicoproteine. Sono più abbondanti nelle cellule che producono secrezioni. Nelle cellule animali possono essere presenti alcune decine di strutture di questo genere, mentre nelle cellule vegetali arrivano fino a centinaia, in quanto partecipano alla costruzione della parete cellulare durante il processo di divisione cellulare. Deve il suo nome a Camillo Golgi, che ne descrisse la struttura nel 1898.

Lisosomi

• Sono organuli ricchi di enzimi digestivi, che vengono qui isolati per non danneggiare il resto della cellula. Versano il loro contenuto all'interno dei vacuoli alimentari formatisi con l'endocitosi, dove effettuano la digestione del materiale fagocitato;
• Si formano in seguito al distacco di vescicole dall'apparato di Golgi.

Nucleo

• È l'organulo che contiene tutte le informazioni genetiche per il controllo del metabolismo cellulare. Ha un diametro di circa 5 micron ed è delimitato da una doppia membrana sulla cui superficie sono presenti dei pori (diametro circa 100 nanometri) che consentiranno l'uscita dell'RNA ed il passaggio di numerose altre sostanze.
• La membrana del nucleo è in diretta continuazione con quella del reticolo endoplasmatico. Il DNA si presenta in forme diverse durante la vita cellulare. Durante le fasi della riproduzione cellulare si presenta suddiviso in cromosomi, strutture generate dall'avvolgimento della doppia elica attorno a proteine, mentre durante il rimanente periodo del ciclo vitale di una cellula appare come una massa indistinta detta cromatina.
• All'interno del nucleo è presente il nucleolo che è incaricato della sintesi dei ribosomi.

Mitocondri

• Sono organuli di forma allungata (da 0,5 a 2 micrometri) e sono le centrali energetiche delle cellule. Sono costituiti da due membrane, la più interna ripiegata a formare delle creste mitocondriali, che aumentano la superficie attiva del corpuscolo.
• In questi organuli avviene la demolizione del glucosio e la produzione di molecole ricche di energia utilizzabile dalla cellula. Il loro numero varia da cellula a cellula; ad es. nel fegato possono essere tra 1000 e 1600, mentre nell'oocita sono anche 30.000.
• Questi organuli contengono, al loro interno, un filamento di DNA a forma circolare e piccoli ribosomi che servono per la sintesi di proteine specifiche del metabolismo degli zuccheri.

Identificazione di colonie batteriche

Piastre di colture batteriche per il riconoscimento nella diagnostica clinica.

Terreni di coltura

• Terreni di trasporto: Conservazione temporanea del microrganismo, non contiene metaboliti essenziali al metabolismo microbico.
• Terreni ricchi: Contengono particolari fattori di crescita che permettono la replicazione della maggior parte dei batteri di interesse medico compresi i patogeni più esigenti: Agar sangue, Agar cioccolato.
• Terreni di arricchimento: Contengono un fattore che favorisce selettivamente la crescita di un particolare microrganismo come il brodo-selenite che favorisce la crescita dei Gram-.
• Terreni selettivi: Terreni solidi che contengono sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni generi batterici consentendo una maggior crescita di altri. EMB, MSA, Sabouraud.
• Terreni differenziali: Contengono sostanze che consentono di sfruttare il diverso aspetto delle colonie distinguendo tra specie di microrganismi differenti. Per i batteri Gram- si utilizza Agar MacConkey (diventa rosso al di sotto di pH 6,8). Lattosio positivi di colore rosso.

Nutrienti nei terreni di coltura

• Peptoni: si tratta di un insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soia);
• NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate alle necessità osmotiche richieste, in vivo, da microrganismi parassiti;
• Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite (mannitolo), sono aggiunti per scopi specifici in terreni particolari.

Arricchimenti

• Estratti: di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici;
• Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina o vitamine. Per la crescita dei batteri esigenti dal punto di vista nutrizionale;
• Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (Sali biliari, cristal violetto, sodio-azide);
• Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc) permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio esaminato, determinando il viraggio di colore del terreno a valori critici di pH.

Tipi di terreni usati in microbiologia

• Columbia Blood Agar Base: Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori).
• Hektoen Enteric Agar: Terreno differenziale e selettivo per l’isolamento di Salmonella e Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H₂S (colonie nerastre, Salmonella).
• MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacità fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).
• Mannitol Salt Agar: Terreno selettivo per l’isolamento di stafilococchi presunti patogeni. S. aureus (coagulasi+) produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.
• Agar candida o Sabouraud: riconoscimento di lieviti e muffe.

Fattori che influenzano la crescita batterica

Temperatura

• Psicrofili: ~0 – 20ºC
• Mesofili: ~10 – 50ºC
• Termofili: ~40 – 75 ºC
• Ipertermofili: ~70 – 110 ºC

pH

• Acidofili: crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente), ne fanno parte funghi e lieviti (pH 5 – 6);
• Neutrofili: crescono tra pH 6 – 8, sono maggior parte dei batteri;
• Alcalofili: crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente).

Concentrazione salina

• Alofili: Crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente ≥1 M), con elevate pressioni osmotiche,