Microbiologia

Lezione 1 - Microbiologia

La mortalità per malattie infettive è cambiata negli ultimi cento anni. Le cause principali di mortalità nei Paesi industrializzati sono:

• MCV
• Tumori
• Patologie polmonari
• Incidenti
• Infezioni dell’apparato respiratorio (influenze – polmoniti)
• Infezioni
• AIDS

La situazione nei Paesi industrializzati, con una mortalità per infezioni del 10 – 15%, è molto diversa dai Paesi in via di sviluppo dove le infezioni contano più della metà delle cause di morte.

La microbiologia e lo studio dei microrganismi

La microbiologia si occupa dello studio dei microrganismi:

• Batteri (organismi procarioti)
• Funghi/Miceti (organismi eucarioti unicellulari – lieviti o pluricellulari – muffe)
• Protozoi (eucarioti unicellulari)
• Elminti/vermi piatti (eucarioti pluricellulari)
• Virus (parassiti intracellulari obbligati – non sono cellule)

Batteriologia generale

Cosa è un batterio?

Un batterio è un organismo procariota:

• Privo di nucleo
• Privo di organelli citoplasmatici
• Il nucleoide – materiale genetico è disperso nel citoplasma e NON è racchiuso da una membrana cellulare.

Nei procarioti, il nucleoide, anche conosciuto come regione nucleare, corpo nucleare o corpo della cromatina, è una regione dalla forma irregolare all'interno della cellula procariote, che contiene materiale genetico costituito da DNA circolare a doppio filamento, di cui possono esistere copie multiple.

Mentre la cellula eucariota ha un nucleo, una membrana nucleare e tutti gli organelli citoplasmatici (apparato del Golgi, RE, mitocondri, cloroplasti se è una cellula vegetale...).

Dimensioni dei batteri

I batteri hanno dimensioni diverse, nell’ordine del micron; ossia sono nell’ambito di risoluzione del microscopio ottico. Esistono batteri più piccoli come i micoplasmi intorno al mezzo micron. Certi bacilli intorno a qualche micron.

• Micoplasma genitalium (0.4 μm)
• H. influenzae (1 μm)
• S. aureus (0.9 μm)
• E. coli (1.5 μm)
• B. megaterium (4 μm)

Un globulo rosso misura 8 μm. Una cellula eucariota è una decina di volte più grande, intorno alla decina di micron. I virus NON possono essere osservati al microscopio ottico, poiché sono nell’ambito di risoluzione del microscopio elettronico.

Forme dei batteri

I batteri hanno forme diverse:

• Forme rotondeggianti: cocchi
• Forme allungate: bacilli
• Forme a spirale
• Forma a virgola: vibrioni
• Forma ondulata: spirocheta
• Forme intermedie – rotondeggianti e allungati: coccobacilli

Com'è fatta una cellula procariotica?

La membrana citoplasmatica è la prima barriera di contenimento: costituita da un doppio strato di fosfolipidi più proteine di membrana. Dunque doppio strato di fosfolipidi con:

• Parte lipidica idrofobica all’interno
• Parte lipidica idrofilica all’esterno
• Proteine di membrana

Le funzioni della membrana citoplasmatica sono funzioni di contenimento:

• Sintesi (lipidi, parete)
• Trasporto (nutrienti)
• Trasduzione segnale
• Chemiotassi
• Trasporto elettroni (respirazione)

Non avendo i mitocondri, utili alla respirazione, la catena di trasporto degli elettroni è svolta nella membrana citoplasmatica. La membrana citoplasmatica è una barriera semipermeabile: consente certi tipi di movimenti dall’esterno all’interno.

Cosa racchiude la membrana plasmatica?

Il citoplasma contiene il:

• Cromosoma batterico senza una membrana nucleare che lo contiene, possono essere presenti anche delle forme di materiale genetico (1-10 Mb); accessorie detti plasmidi (1-100 kb)
• Proteine solubili ("housekeeping")
• Ribosomi – per sintesi proteica
• Granuli di riserva (glicogeno, polisaccaridi, polifosfati)

Elementi genetici di una cellula batterica

Cromosoma: struttura fondamentale della cellula batterica.

• Ha dimensioni variabili (4,000 – 9,000 Kb a seconda del batterio).
• È a doppio filamento generalmente circolare.
• Ce ne sono da 1 a 4 copie per cellula.

Solitamente la cellula batterica ha un cromosoma; però può succedere che siccome non vi è una perfetta sincronia tra la replicazione del cromosoma e la replicazione della cellula della parete degli altri elementi cellulari, può capitare che una cellula sia sempre in uno stato di divisione e quindi il cromosoma si sia già replicato per le cellule figlie, ma le cellule figlie non si siano ancora divise.

Elementi extracromosomici "mobili" – contengono geni non essenziali ma accessori.

Elementi accessori mobili - Plasmidi

• Elementi accessori mobili.
• Capaci di replicazione autonoma anche fino a centinaia di copie per cellula.

Elementi accessori mobili - Sequenze di inserzione, Trasposoni, Fagi

• Elementi accessori mobili.
• Incapaci di replicazione autonoma. Per replicarsi devono replicarsi insieme al cromosoma, integrati al cromosoma o insieme ai plasmidi.

Una caratteristica di questi elementi genetici mobili è il fatto di portare dei geni importanti per la sopravvivenza batterica in certi ambienti/situazioni. Possono portare dei geni che codificano:

• Per fattori di resistenza di antibiotici
• Per fattori di virulenza

Cosa c’è all’esterno della membrana plasmatica?

La parete batterica:

• Supporto meccanico rigido
• Forma alla cellula
• Impedisce la lisi osmotica
• Permeabile ai soluti

La parete batterica è composta principalmente dal peptidoglicano, una struttura fatta da:

• Zuccheri acetilati
• Peptidi

Il monomero base del peptidoglicano è costituito da:

• 2 zuccheri acetilati principali detti NAM – acido N – acetilmuramico NAG – N – acetilglucosammina

Il NAM e il NAG sono legati da un legame BETA 1 – 4 glicosidico. Attaccato al NAM ci sono degli amminoacidi che costituiscono un tetrapeptide. 4 amminoacidi:

• L – Alanina
• Acido D – glutamico
• L – lisina o acido mesodiaminopimelico (non lo possiede l’uomo)
• D – alanina

Dunque ci sono degli AA particolari che noi non possediamo. Questi monomeri nello spazio si sistemano attraverso una successione di zuccheri disposti su piani paralleli, con legami perpendicolari al fine di rendere la struttura resistente/rigidità.

• In una direzione vi è il legame BETA 1 – 4 glicosidico tra NAM e NAG; tra i due zuccheri acetilati.
• Nella direzione perpendicolare c’è un legame peptidico tra il terzo AA di uno strato e il quarto AA dello strato successivo: LEGAME PEPTIDICO tra L – lisina/acido mesodiaminopimelico e D – alanina

Struttura del peptidoglicano in batteri diversi

Il legame trasversale tra il terzo AA e il quarto AA del successivo può essere un:

• Legame diretto
• Legame indiretto e mediato da altri AA; le cosiddette glicine (5 glicine)

Ci sono alcuni microrganismi che hanno un peptidoglicano in cui il legame peptidico è diretto. Altri microrganismi in cui il legame peptidico è indiretto mediato da 5 glicine.

Colorazione di Gram

Permette di distinguere i batteri in Gram positivi e in Gram negativi a seconda della struttura della parete. La colorazione di Gram è una colorazione differenziale. Ha permesso di dividere il grande mondo dei batteri in 2 gruppi:

• Batteri Gram positivi – azzurri
• Batteri Gram negativi – rosa

È una colorazione differenziale perché prevede l’uso successivo di 2 coloranti:

• Crystal violetto – colorante azzurro
• Safranina – colorante rosa

Per prima cosa occorre fissare una colonia batterica/un preparato/un campione biologico ad un vetrino. Il fissaggio si può fare per:

• Via chimica – metanolo
• Via fisica – calore

Il fissaggio ha due funzioni importanti:

• Attaccare i batteri al vetrino
• Uccidere i batteri e lavorare in biosicurezza

1. Dopodiché il vetrino viene immerso per circa un minuto in crystal violetto.
2. Viene lavato con acqua.
3. Viene usato un mordenzante, ossia una soluzione a base di iodio detto reattivo di Lugol, che va a far fare una sorte di legami crociati al crystal violetto nel peptidoglicano.
4. Successivamente si ha un altro lavaggio in acqua.
5. Si attua una decolorazione con una soluzione alcolica acida.
6. Infine si fa una colorazione di contrasto con safranina.

I batteri Gram positivi, che hanno una parete molto robusta, assumono il crystal violetto; NON si decolorano al momento della colorazione; assumono poco della colorazione con la safranina poiché rimane attaccato al peptidoglicano la colorazione con il crystal violetto.

Il Gram negativo si colora con il crystal violetto. Però al momento della decolorazione perde completamente il primo colorante e si andrà a colorare con la safranina.

Motivo della differenza di colorazione

Nel caso di un Gram positivo, la parete è costituita da uno strato spesso di peptidoglicano, che assorbe il primo colorante, il crystal violetto, e NON lo rilascia con la decolorazione e quindi rimane colorato di blu. Mentre in Gram negativo ha una parete costituita da vari strati. Lo strato di peptidoglicano è molto più sottile rispetto al Gram positivo. Dunque il Gram negativo assume il crystal violetto nel peptidoglicano; tuttavia al momento della decolorazione il peptidoglicano perde il colorante e viene assunto il colorante rosa nella colorazione di contrasto – il Gram negativo apparirà colorato di rosa.

Struttura parete dei Gram positivi e dei Gram negativi a confronto

I batteri Gram-positivi hanno un peptidoglicano molto più spesso dei Gram-negativi!

Gram-positivi

• La parete/cell wall è costituita per gran parte di peptidoglicano (30-80% parete – strato spesso di peptidoglicano)
• Acidi teicoici/lipoteicoici, a seconda se prendono origine dalla membrana plasmatica (10% peso secco cellula).
• Polimeri di alcoli (ribitolo e glicerolo) esterificati con ac. Fosforico

Gram-negativi

• Hanno uno strato sottile di peptidoglicano; senza acidi teicoici
• Spazio periplasmatico, al quale sono ancorate lipoproteine di Braun

Queste lipoproteine ancorano il peptidoglicano allo strato successivo, ossia alla Membrana esterna (porine e LPS). La Membrana esterna è una membrana simile alla membrana citoplasmatica, costituita da un doppio strato di fosfolipidi e proteine. Possiede strutture a canale, le cosiddette porine, per il passaggio di soluti dall’interno all’esterno e viceversa. Dove le porine è localizzata una struttura molto importante, detta LPS/lipopolisaccaride/endotossina.

Struttura del LPS/lipopolisaccaride/endotossina

È fatta da lipidi + zuccheri. La parte zuccherina è rivolta verso l’esterno. È costituita dal:

• Core polisaccaridico
• Antigene O – dà specificità di specie in certi batteri Gram negativi, fatta da una ripetizione di zuccheri diversi a seconda del microrganismo.

Immerso nella membrana esterna, ci sono gli acidi grassi/lipide A con azione tossica. L’endotossina è una tossina presente in tutti i batteri Gram negativi ed è parte integrante della struttura della membrana esterna, della parete.

• Viene liberata solo se il batterio lisa/muore.

Componenti accessori della cellula batterica

Capsula

• Composta da polisaccaridi
• Conferisce resistenza alla fagocitosi

Flagelli

• Organi di movimento
• Il flagello è formato da una parte per ancorarsi alla parete batterica, ossia dal corpo basale e dall’uncino; da un filamento che propende verso l’esterno
• La rotazione del flagello è energia – dipendente
• Dipende da vari stimoli chemiotattici, aereotattici, fototattici, termotattici

I flagelli possono essere presenti su tutta la superficie batterica: in tal caso si parla di flagelli peritrichi. Batteri con un solo flagello sono detti flagelli monotrichi. Inoltre vi sono batteri che hanno un flagello intracellulare/endoflagello, dotati di un movimento ondulatorio diverso dai batteri che possiedono flagelli esterni.

Pili

Sono organi di adesione, anche se esistono dei pili sessuali utili allo scambio genico. Composti da una proteina: pilina. I pili conferiscono il tropismo di tessuto al batterio di organi di tessuto. Sulla punta del pilo vi è una sorta di anti–recettore, che andrà a legarsi a recettori specifici presenti su una cellula ospite.

• Adesione/colonizzazione
• Coniugazione (pili sessuali)

I pili sono importanti nell'adesione alle superfici mucose.

Le spore

Prodotte da Bacillus, Clostridium, actinomiceti e sarcine; hanno la capacità, in certe condizioni avverse, di trasformare la cellula batterica in una spora.

• Le spore sono metabolicamente inattive e possono rimanere tali per moltissimo tempo.

Forme batteriche criptobiotiche adattate a condizioni ambientali sfavorevoli (essiccamento, variazioni di pH, CO₂, O₂, radiazioni, mancanza di nutrienti).

• Sporulazione: la cellula batterica vegetativa si trasforma via via e va a costituire la spora.
• Germinazione: la spora riassume acqua dall’esterno; andrà a germinare per ridar vita alla cellula vegetativa.

Struttura della spora

Sono delle forme particolarmente resistenti. Sono costituite da una serie di strati concentrici, uno sopra all’altro, che li rendono resistenti all’ambiente esterno. Spora essiccata/priva d’acqua è resistente agli agenti esterni.

Tindalizzazione

Si induce la spora a germinare. Siccome la forma vegetativa del batterio è molto meno resistente della spora, al momento in cui tutte le spore hanno germinato, a questo punto si può procedere con l’inattivazione di tutte le forme vegetative, tramite anche bollitura o altri sistemi.

Patogenicità batterica

Infezione: quel processo che porta alla colonizzazione/invasione e moltiplicazione con o senza sviluppo di malattia/infezioni asintomatiche.

• Patogenicità batterica: capacità di un batterio di dare danno a un ospite
• Virulenza: misura del grado di patogenicità; confronta due casi clinici della stessa specie, entrambi patogeni, definendo quali dei due casi è più virulento/dannoso dell’altro.
• Relazione ospite – parassita
• Triade della malattia; ai cui vertici di questo triangolo troviamo da una parte il patogeno, l’ospite e l’ambiente.

Dunque chi contribuisce alla malattia non è soltanto il patogeno, ma è anche l’ospite nella cosiddetta relazione ospite – parassita, e l’ambiente per condizioni socio sanitarie/igieniche diverse, condizioni di affollamento, la qualità dell’aria, la stagionalità, la qualità dell’acqua, la sanificazione…

La relazione ospite – parassita

La relazione ospite – parassita comprende:

• Mutualismo: relazione di beneficio reciproco; sia il batterio che l’ospite traggono vantaggio da questa relazione di mutualismo
• Commensalismo: simile al mutualismo; è una relazione di indifferenza reciproca; tipica del microbiota.
• Parassitismo: è una condizione di danno del patogeno rispetto all’ospite; è quello che generalmente attuano i virus nei confronti dell’ospite.

Dunque si distinguono batteri:

• Non–patogeni: avranno una relazione di mutualismo con l’ospite
• Patogeni opportunisti: commensali che possono diventare patogeni in certe condizioni
• Patogeni obbligati: avranno sempre una relazione di danno

Microbiota in vari distretti

Il microbiota costituisce tutta la popolazione microbica che fa parte di un individuo umano. Microbioma: sono i genomi; TUTTO il pool genico del microbiota umano.

Un articolo scientifico ha messo in evidenza come il nostro organismo sia popolato sì da cellule eucariotiche, ma da un numero almeno equivalente se non superiore (10 volte tanto) di cellule microbiche. Questo va a costituire il nostro organismo, fatto di:

• Cellule eucariotiche
• Cellule procariotiche – in maniera molto maggiore

Abbiamo più o meno 10 volte tante cellule microbiche/microbi, rispetto alle cellule eucariotiche. Abbiamo molti più geni microbici (9 milioni di geni) rispetto a 23 mila geni eucariotici.

• Due individui sono al 99,9% identici tra loro in termini di genoma eucariota.
• Mentre l’80% - 90% di individui sono differenti l’uno dall’altro in termini di microbioma.

Tutto ciò ha fatto nascere la domanda: il nostro organismo è Homo sapiens o Homo bacteriensis? Cioè, noi essendo composti da più cellule batteriche rispetto alle cellule eucariotiche. Dunque il microbiota è una costituente fondamentale del nostro organismo. Vi è una grande crescita della ricerca in questo ambito, con dati/informazioni che caratterizzano il microbiota nei vari distretti.

È fatto in gran parte di cellule batteriche, ma in realtà in certi distretti vi è anche una componente fungina/funghi/micobiota; dei virus/virobiota residenti – sia rappresentati dai virus batterici che infettano i batteri, che dai virus animali e vegetali assunti con la dieta.

Microbiota in vari distretti – quasi tutto il nostro organismo è occupato dal Microbiota

• Cute
• Cavità orale
• Apparato gastro – intestinale
• Apparato respiratorio
• Apparato genito – urinario

Campioni e distretti corporei microbiologicamente «sterili»

Vi sono dei distretti che generalmente sono microbiologicamente sterili, ossia che in condizioni normali NON hanno una popolazione microbica:

• SNC