Test di fluttuazione

RESISTENZA MICROBIOCA E SENSIBILITA’

I terreni di coltura solidi sono terreni liquidi che vengono agarizzati generalmente in piastre di Petri. Le piastre vengono utilizzate sia per propagare o conservare o isolare determinati microrganismi o popolazioni axeniche (= pura perché costituita da una sola specie mentre sono le colonie ad essere geneticamente uniformi) a partire da popolazioni miste sia per effettuare test di antibiogrammi (come tampone faringeo di una piaga o anche analisi urine): con un bastoncino di cotone si prelevano le popolazione microbiche presenti in determinato sito per farle amplificare in una cultura liquida, successivamente il tutto viene distribuito su un terreno di cultura di una piastra solida. In assenza di antibiotici, l’indomani si noterà una patina bianca che rappresenta i microrganismi che hanno avuto possibilità di crescere andando ad occupare tutto lo spazio sul terreno di coltura.

Per evitare la crescita esponenziale dei microrganismi, bisogna apporre sulle piastre dei dischetti imbevuti di diversi antibiotici. L’antibiotico tende a diffondere dal dischetto verso il terreno di cultura, di conseguenza avremo una concentrazione decrescente a partire dal centro del dischetto (dove è più concentrato) e man mano che si diffonde diminuisce in concentrazione perché si diluisce nel terreno. L’indomani si noteranno aloni di inibizione della crescita microbica: più i microrganismi (che ovviamente devono essere sensibili all’antibiotico!!) sono vicini al dischetto più la loro duplicazione viene bloccata grazie all’antibiotico. Più l’alone è grande più la popolazione microbica all’estremo dell’alone è sensibile perché viene inibita da concentrazioni dell’antibiotico minori. Per poter confrontare i vari risultati avuti anche da laboratori diversi sono necessari degli standard, che riguarda l’utilizzo di una data e precisa concentrazione dell’antibiotico, e di limiti circa la grandezza dell’alone di inibizione: se l’alone è di 2 cm di diametro (o 1 cm di raggio), il microrganismo viene considerato per convenzione sensibile, se l’alone è minore di 2 cm, il microrganismo è resistente. La foto mostra come dal 2009, una stessa popolazione microbica tutti sensibili agli antibiotici, si è passati al 2019 dove gli stessi microrganismi sono ormai divenuti tutti resistenti agli stessi antibiotici.

Gli end point indicano che microrganismi, che sono al limite della sensibilità ad un dato antibiotico, non devono essere esposti allo stesso antibiotico a concentrazioni più elevate perché è proprio tale esposizione a permettergli il salto alla resistenza.

L’OMS prevede che, in seguito all’insorgenza di meccanismi di resistenza, la mortalità sarà di lunga superiore a quelle che si stanno verificando ad oggi e che, addirittura, entro il 2050 ci saranno 10 milioni di decessi, superando in numero quelli dovuti a cancro.

Alcuni studiosi hanno fatto solidificare, e quindi agarizzare, un terreno liquido in una piastra rettangolare in cui sono state poste concentrazioni crescenti x10 verso il centro di un determinato antibiotico. Partendo da popolazioni microbiche axeniche (stessa specie) sensibili a tale antibiotico, si è visto che inizialmente la crescita batterica si fermava quando si raggiungeva un minimo di

RESISTENZA MICROBICA E SENSIBILITA'

I terreni di coltura solidi sono terreni liquidi che vengono agarizzati generalmente in piastre di Petri.

Le piastre vengono utilizzate sia per propagare o conservare o isolare determinati microrganismi o popolazioni axeniche (= pura perché costituita da una sola specie mentre sono le colonie ad essere geneticamente uniformi) a partire da popolazioni miste sia per effettuare test di antibiogrammi (come tampone faringeo di una piaga o anche analisi urine); con un bastoncino di cotone si prelevano le popolazione microbiche presenti in determinato sito per farle amplificare in una cultura liquida, successivamente il tutto viene distribuito su un terreno di cultura di una piastra solida.

In assenza di antibiotici, l’indomani si noterà una patina bianca che rappresenta i microrganismi che hanno avuto possibilità di crescere andando ad occupare tutto lo spazio sul terreno di coltura.

Per evitare la crescita esponenziale dei microrganismi, bisogna apporre sulle piastre dei dischetti imbevuti di diversi antibiotici.

L’antibiotico tende a diffondere dal dischetto verso il terreno di cultura, di conseguenza avremo una concentrazione decrescente a partire dal centro del dischetto (dove è più concentrato) e man mano che si diffonde diminuisce in concentrazione perché si diluisce nel terreno.

L’indomani si noteranno aloni di inibizione della crescita microbica: più i microrganismi (che ovviamente devono essere sensibili all’antibiotico!!) sono vicini al dischetto più la loro duplicazione viene bloccata grazie all’antibiotico.

Più l’alone è grande più la popolazione microbica all’estremo dell’alone è sensibile perché viene inibita da concentrazioni dell’antibiotico minori.

Per poter confrontare i vari risultati avuti anche da laboratori diversi sono necessari degli standard, che riguarda l’utilizzo di una data e precisa concentrazione dell’antibiotico, e di limiti circa la grandezza dell’alone di inibizione: se l’alone è di 2 cm di diametro (o 1cm di raggio), il microrganismo viene considerato per convenzione sensibile, se l’alone è minore di 2 cm, il microrganismo è resistente.

La foto mostra come dal 2009, una stessa popolazione microbica tutti sensibili agli antibiotici, si è passati al 2019 dove gli stessi microrganismi sono ormai divenuti tutti resistenti agli stessi antibiotici.

Gli end point indicano che microrganismi, che sono al limite della sensibilità ad un dato antibiotico, non devono essere esposti allo stesso antibiotico a concentrazioni più elevate perché è proprio tale esposizione a permettere il salto alla resistenza.

L’OMS prevede che, in seguito all’insorgenza di meccanismi di resistenza, la mortalità sarà di lunga superiore a quelle che si stanno verificando ad oggi e che, addirittura, entro il 2050 ci saranno 10 milioni di decessi, superando in numero quelli dovuti a cancro.

Alcuni studiosi hanno fatto solidificare, e quindi agarizzare, un terreno liquido in una piastra rettangolare in cui sono state poste concentrazioni crescenti x10 verso il centro di un determinato antibiotico.

Partendo da popolazioni microbiche axeniche (stessa specie) sensibili a tale antibiotico, si è visto che inizialmente la crescita batterica si fermava quando si raggiungeva un minimo di concentrazione.

concentrazione di antibiotico eccetto che, dopo un giorno, iniziano a comparire degli spot, ovvero

cellule che diventano o erano resistenti all'antibiotico e che quindi continuano ad accrescersi

(duplicando) invadendo man mano la piastra verso il centro, colonizzando tutta la piastra in 4 giorni (

e ciò avviene ciclicamente ad ogni break di aumento di concentrazione). Ovviamente se la

concentrazione finale, quella più alta, fosse stata messa all'inizio a contatto con quella popolazione,

tutta la popolazione sarebbe andata incontro a morte. Utilizzare concentrazioni graduali di antibiotico

ha permesso la sopravvivenza di quelle cellule, all'interno di uno stesso ceppo, che erano resistenti

all'antibiotico.

DEFINIZIONE BIOLOGICA: In laboratorio, la resistenza di un microrganismo viene valutata in vitro

in base alla sua capacità di crescere in presenza di un farmaco antimicrobico. Un microrganismo è

considerato resistente quando riesce a moltiplicarsi anche a concentrazioni dell'antibiotico

significativamente più elevate (circa 10 volte o più) rispetto a quelle che inibiscono o uccidono la

maggior parte dei sierotipi della stessa specie. Al contrario, un microrganismo è considerato

sensibile quando la sua crescita viene inibita da concentrazioni del farmaco simili o inferiori a quelle

efficaci contro la maggior parte dei ceppi della stessa specie. (Ex: streptococcus pyogenes (Genere:

streptococcus; Specie: pyogenes), in base alla proteina M, si divide in 100 diversi sierotipi). Immagina che

il 90-95% dei ceppi di una specie batterica venga bloccato da 1 mg/L di antibiotico:

• Se un ceppo viene bloccato a 1 mg/L ➔ sensibile.
• Se per bloccarlo servono 10 mg/L o più ➔ resistente.

DEFINIZIONE CLINICA: bisogna vedere la quantità di farmaco (antibiotico o antifungino) circolante

dato che non possiamo vedere quanto farmaco è andato direttamente nel sito di infezione. Sensibile

= concentrazione raggiungibile nel paziente > concentrazione necessaria per inibire il batterio

(MIC/CIM).

Dunque, dipende dall'emivita del farmaco, dallo stato del paziente, da quanto farmaco il paziente

riesce a metabolizzare e così via. La definizione clinica di sensibilità tiene conto non solo della

susceptibilità del microrganismo in vitro, ma anche delle concentrazioni di antibiotico che possono

essere raggiunte nell'organismo del paziente. Questo dipendono dalle caratteristiche

farmacocinetiche del farmaco (assorbimento, distribuzione, metabolismo ed eliminazione) e dalle

condizioni del paziente. Un microrganismo è considerato sensibile quando le concentrazioni del

farmaco ottenibili con i normali schemi terapeutici sono sufficienti a inibirne la crescita e a garantire

un'elevata probabilità di successo clinico. Esempio: Immagina che per bloccare un batterio servano 2

mg/L di antibiotico.

• Se con la terapia standard nel paziente si raggiungono 10 mg/L ➔ il batterio è sensibile.
• Se si raggiunge solo 1 mg/L ➔ il batterio è resistente, perché non si ottiene una concentrazione

sufficiente a controllarlo.

La resistenza è stata evidenziata, non solo sperimentalmente, ma anche empiricamente: da quando

si è iniziata ad affermare la teorica circa l'eziologia microbica delle patologie, è subito visto che a

partire da una popolazione axenica (costituita dalla stessa specie come ad esempio salmonella), se

questa deve essere trattata con una determinata concentrazione di antibiotico ne deve essere

utilizzata una concentrazione molto elevata per un periodo sufficiente di trattamento in modo da

debellare tutta la popolazione subito, altrimenti si osserva che da questa popolazione di salmonella

possono sopravvivere (al trattamento antibiotico) anche solo 2 batteri, questi per scissione binaria duplicano (nel giro di 20 min avrò la fase logaritmica) trasformandosi così in una popolazione ora costituita dai ceppi resistente all’antibiotico utilizzato precedentemente. Ad oggi sappiamo che l’antibiotico non ha indotto la mutazione ma utilizzando l’antibiotico, questo ha selezionato, e quindi ucciso, solo i batteri sensibili permettendo al contempo la duplicazione, e quindi la sopravvivenza, di quei batteri che erano già resistenti.

Nei primi anni ’40 gli scienziati iniziarono a porsi tale domanda: l’antibiotico, che rappresenta l’ambiente, ha indotto nei batteri tale mutazione o i batteri resistenti sono già presenti e l’antibiotico, uccidendo quelli sensibili, non ha fatto altro che selezionarli? Il mondo scientifico iniziò ad interrogarsi sulle mutazioni ed inizialmente non era chiaro se le mutazioni comparissero spontaneamente o in risposta ad una selezione. Gli scienziati si divisero in due:

• Sostenitori della teoria evoluzionistica di Darwin (ad oggi quella più accertata), secondo cui ci sono dei caratteri ereditari, oggi definite mutazioni, che compaiono continuamente e spontaneamente andandosi ad accumulare in una popolazione batterica e che possono favorire o sfavorire la sopravvivenza della popolazione nell’ambiente;

Dove sbaglia Darwin? “SALTO DI SPECIE”. Secondo Darwin tutto nasce da un progenitore comune che è però plausibile solo se parliamo a livello cellulare ma non applicabile a specie viventi diversi.

• Sostenitori di Lamark, secondo cui le mutazioni fossero il risultato dell’adattamento dell’organismo ad uno specifico agente selettivo (concetto dell’uso/disuso), in grado quindi di indurre variazioni nel materiale genetico (ex: collo giraffa).

A porre fine a tali controversie (è l’ambiente ad indurre mutazioni o semplicemente seleziona le mutazioni?) S. Luria e M. Delbrück dimostrarono tramite il TEST DI FLUTTUAZIONE (perché i numeri di colonie ottenute fluttuavano) come compaiono le mutazioni.

Il test è stato eseguito su microrganismi ma il risultato vale anche per le cellule eucariotiche di mammifero: la scelta dei microrganismi è stata fatta per ridurre il tempo dell’esperimento. Utilizzare,

ad esempio, i topi avrebbe allungato di molto le tempistiche dato che i tempi di riproduzione dei topi è molto lungo (deve rimanere incinta + tempi di gravidanza) mentre i batteri ogni 20 min replicano. Lo scopo dell'esperimento è quello di dimostrare che partendo da una popolazione sensibile si ottiene una popolazione resistente.

L'esperimento viene effettuato su batterio E. coli sensibile al batteriofago T1 che, dopo replicazioni, diventata resistente allo stesso batteriofago. È stato il batteriofago ad indurre la resistenza in coli o nelle popolazioni erano già presenti coli resistenti al batteriofago iniziale?

Per evitare inquinamento sperimentale, partono da una colonia di E. coli perché all'interno della colonia stessa sono presenti cellule (pure) geneticamente uniformi aventi più o meno lo stesso DNA e, di conseguenza, tutte sensibili al batteriofago. La colonia viene messa tutta in coltura liquida di 1 litro in una beuta e, dopo aver aspettato tot tempo per la crescita, la coltura liquida viene divisa equamente in 500 mL in due diverse beute. Dopo aver aspettato altro tempo per la crescita, il contenuto della prima beuta viene diviso in 50 diverse provette, ognuna contente 10 mL di coltura liquida, mentre il contenuto della seconda beuta viene messo nuovamente tutto insieme, quindi tutti i 500 mL, in una stessa beuta. Arrivati a questo punto, il batteriofago ancora non è presente quindi se ci sono e. coli sensibili o resistenti non è ancora possibile vederlo; per di più è possibile vederlo solo su terreno solido che contiene anche il batteriofago. Da ognuna delle 50 provette viene prelevata un'aliquota e posta su 50 diverse piastre contenenti il batteriofago mentre a partire dalla beuta contenente i restanti 500 mL viene prelevata la stessa aliquota e posizionata su 50 piastre diverse contenenti il batteriofago.

Notiamo come nella prima lato i numeri di colonie (sono rimaste solo le cellule resistenti al batteriofago ovviamente) in piastra variano di tantissimo, da 500 a 10 ad addirittura non presenti (= i numeri fluttuano). Nel secondo lato invece sono state riscontrate mediamente 10 colonie su ogni piastra (errore umano di prelievo tramite pipetta ha portato a piccole differenze: 9, 10, 12 colonie su ogni piastra e così via).

Deduzioni:

1. NON È STATO IL BATTERIOFAGO (o ambiente) AD INDURRE MUTAZIONE

Se fosse stato vero che è l'ambiente (cioè il batteriofago) a modificare il microbo in modo da renderlo resistente ci sarebbero stati lo stesso numero di colonie su tutte le piastre ad ambo i lati perché il batteriofago è presente nelle stesse concentrazioni in tutte le piastre e perché abbiamo posizionato una stessa aliquota di coltura, quindi uno stesso numero di cellule. Nel secondo lato ottengo un numero pressoché uguale perché le aliquote provengono da una stessa beuta, e quindi all'interno è presente una popolazione più o meno omogena. A parte l'errore di pipettata, i resistenti e i sensibili si sono distribuiti nello stesso ambiente e probabilisticamente in ogni aliquota che prelevo è presente lo stesso numero di resistenti e sensibili. Quindi le mutazioni insorgono in modo casuale ed indipendentemente dall'ambiente.

1. LE MUTAZIONI SONO RARE

Da 100.000 cellule sensibili poste su piastra, solo 10 sono risultate resistenti.

1. LE MUTAZIONI SONO EREDITABILI