Tecnologie del DNA ricombinante

Tecnologia del DNA ricombinante - Ingegneria genetica

L'ingegneria genetica definisce una serie di metodiche meglio note come tecnologie del DNA ricombinante, cioè tecniche di analisi molecolare finalizzate all'individuazione e all'analisi più approfondita di specifiche sequenze geniche appartenenti a un ben determinato organismo vivente, che non sia necessariamente umano. La tecnologia del DNA ricombinante definisce una serie di metodologie sperimentali tramite le quali il ricercatore è in grado di isolare del materiale genetico, analizzarne le caratteristiche e osservarne il comportamento in determinati organismi. L’ingegneria genetica trova largo impiego in molti contesti del mondo attuale, rivelandosi utile per l’ambito farmacologico, diagnostico, terapeutico, agricolo e bioenergetico.

Applicazioni farmacologiche e terapeutiche

Nell’ambito farmacologico e terapeutico l'ingegneria genetica si è rivelata di vitale importanza per la produzione di agenti ricombinanti o veri e propri farmaci, utili alla risoluzione di specifici problemi:

• Insulina umana: rilasciata nel 1979, ha salvato molti diabetici che avevano sviluppato evidenti reazioni allergiche all’insulina estratta dai bovini. L’ingegneria genetica ha consentito di isolare il gene che nell’uomo codifica per l’insulina, di inserirlo in un plasmide, vettore utile al trasporto del gene nel batterio, facendo sì che il procariote potesse sintetizzarlo.
• Attivatori tissutali del plasminogeno: il plasminogeno è il precursore della plasmina, enzima utile alla degradazione del reticolo di fibrina, parte integrante di formazioni trombotiche. Viene utilizzata su pazienti esposti ad eventi cardiovascolari.
• Ormone della crescita: somministrato soprattutto a coloro che soffrono di un deficit nel processo di crescita.
• Fattori della coagulazione: utile per coloro che soffrono di emofilia.

Operatività della tecnologia del DNA ricombinante

Operativamente la tecnologia del DNA ricombinante è complessa; concettualmente si fonda su metodi e criteri più semplici da capire:

• Individuare il gene di interesse, tagliarlo ed isolarlo rispetto al resto del materiale nucleotidico.
• Individuazione e preparazione di un vettore biologico, come un vettore virale o un generico plasmide.
• Creazione del DNA ricombinante tramite enzimi come quelli della classe delle ligasi.
• Trasferimento del DNA ricombinante in un organismo ospite.
• Osservazione e studio del comportamento biologico e genetico del DNA ricombinante nell’ospite.

STEP 1 - Individuazione ed isolamento della sequenza genica dal DNA umano

Il problema principale in questa circostanza è innanzitutto l'individuazione del gene, che obiettivamente occupa una posizione infinitamente piccola (circa 3000 pb) rispetto al resto del genoma (aploide - 3.2 mld bp). Il secondo problema consiste nella ricerca di un metodo efficace per poterlo isolare.

A questo proposito, un evento centrale nel mondo della ricerca fu rappresentato dalla scoperta di una delle più importanti categorie enzimatiche in ambito ingegneristico, le endonucleasi di restrizione di tipo II, enzimi sintetizzati dai procarioti come arma di difesa utile alla degradazione del DNA virale inoculato da batteriofagi. Tali enzimi di restrizione aderiscono a delle sequenze di DNA, denominate sequenze di riconoscimento, per poi eseguire un taglio. Il DNA procariotico si auto-difende da questo attacco, metilando (tramite enzimi metilasi) i siti del genoma più vulnerabili. Le endonucleasi di restrizione di tipo II designano una grande famiglia di enzimi ad attività litica e sito-specifica. Per ogni specifica sequenza, esiste un determinato enzima.

Soltamente gli enzimi di restrizione intervengono a livello di sequenze palindrome, cioè porzioni di DNA a livello delle quali i due filamenti sono palindromi (possono quindi essere letti allo stesso modo ma in senso inverso). Le palindrome sono regioni poco ampie, che vanno dalle 4 alle 8 coppie di basi.

Per quanto riguarda le modalità di taglio endonucleotidico:

• Tagli endonucleotidici sfalsati - Estremità adesive (Sticky Ends): l’enzima di restrizione (spesso HIND III) esegue due tagli in regioni differenti, determinando la frammentazione del DNA in due porzioni le cui estremità sono complementari. A livello della regione tagliata, è possibile introdurre una nuova molecola di DNA, sempre rispettando la complementarietà con l’estremità adesiva. Il legame viene saldato da una DNA ligasi.
• Tagli che producono estremità piatte: enzimi di restrizione come PVULL operano due tagli su siti concordi e non discordi. Ne deriva la formazione di estremità coesive.

STEP 2 - Verifica dell’operato dell’enzima di restrizione e valutazione delle sequenze di DNA ottenute

Una metodica particolarmente sfruttata per l’analisi di singoli frammenti di DNA, utile all’identificazione della loro grandezza o della carica elettrica ad essi associata, è l’elettroforesi, in particolare l’elettroforesi su gel di agarosio. Prima di entrare nel merito dell'esperimento, è necessario comprendere il meccanismo che si cela dietro un test molecolare simile.

La sostanza impiegata è del gel di agarosio, una sostanza colloidale porosa, che in determinate condizioni ambientali riesce a solidificarsi. Il gel di agarosio viene inserito all’interno di uno stampo, solitamente di plastica, in maniera tale che si solidifichi, riempiendo lo spazio nel quale è stato inserito. Una volta solidificato, a monte delle singole colonne di gel, vengono creati dei pozzetti nei quali vengono inseriti campioni contenenti diverse molecole di DNA a diverso peso molecolare, cioè di diversa lunghezza. Il sistema di elettroforesi dispone di due piastre elettriche: alla sommità è presente un polo negativo, alla base uno positivo. Attivando il circuito elettrico, le singole molecole di DNA man non migreranno verso il polo positivo, in virtù della carica elettrica negativa associata agli ortofosfati.

Data la porosità del gel, i frammenti di DNA più piccoli attraverseranno con una maggiore facilità il contenuto colloidale, raggiungendo la base. I frammenti di DNA più grandi, poiché attraversano con maggiore difficoltà...