Tecnologie ricombinanti

Tecnologie ricombinanti

Storia

• Mendel formulò una serie di leggi per spiegare l’ereditarietà dei caratteri nel 1860 biologici. In particolare egli effettuando incroci con le piante di pisello scoprì l’esistenza di una particella fisica chiamata gene in grado di controllare ogni caratteristica ereditabile di un organismo vivente. Tuttavia ai suoi tempi Mendel non venne compreso.

• Nel 1900 le leggi di Mendel vennero riscoperte da alcuni ricercatori, che compresero anche che i geni erano delle entità fisiche che potevano essere localizzate in un preciso luogo fisico contenente informazione. Questo luogo fisico prese il nome di cromosoma.

• La natura molecolare dei geni venne realmente compresa dopo il 1940, grazie agli esperimenti di Avery, MacLeod e McCarty e poi grazie agli esperimenti di Haeshey e Chase. In particolare venne dimostrato che il materiale genetico era costituito da DNA e non da proteine, come si riteneva fino ad allora.

• Nel 1960 venne identificata la struttura del DNA, decifrato il codice genetico e si iniziarono a studiare i processi di trascrizione e traduzione, quindi si capì come da una successione di nucleotidi era possibile ottenere una successione di amminoacidi.

• Nella seconda metà degli anni 70 si svilupparono nuove tecniche di tecnologia del DNA ricombinante o di ingegneria genetica, grazie alle quali divenne possibile sequenziare il DNA mediante gli enzimi di restrizione e grazie alla quale venne messo in atto il clonaggio genico. Il clonaggio genico consiste nell’isolare una molecola di DNA dal resto del DNA che lo circonda, trasferirla in una seconda molecola di DNA che funge da trasportatore e farla replicare in modo da dare origine a migliaia o milioni di copie. Quindi il clonaggio genico ci permette di amplificare una specifica porzione di un gene a cui siamo interessati e si differenzia dalla clonazione, che invece è la produzione di più copie a partire da una molecola o da un intero organismo.

Introduzione

Il clonaggio genico è un’operazione che prevede una serie di passaggi che devono essere fatti in maniera corretta per avere un risultato. I passaggi fondamentali sono:

• Ottenere un frammento di DNA che contenga il gene da clonare unire questo frammento di DNA ad un’altra molecola di DNA circolare di provenienza diversa, che chiamiamo vettore, per produrre una molecola di DNA ricombinante o ibrida, costituita dai due frammenti di DNA di provenienza diversa.

• Il vettore serve a trasportare il gene al quale siamo interessati all’interno di una cellula ospite, che nel caso più semplice è una cellula batterica, all’interno della quale il DNA ricombinante si replica in un numero di copie preciso, grazie ai sistemi enzimatici presenti nella cellula ospite.

• Ad un certo punto la cellula ospite si divide e trasferisce parte delle molecole di DNA ricombinante che sono state prodotte alle cellule figlie. Questo determina un’amplificazione, poiché a partire da una cellula madre, nell’ambito di poco tempo, si avranno un numero elevato di cellule figlie, che contengono al loro interno un numero elevato di molecole di DNA ibrido. Il risultato delle divisioni sarà quindi la formazione di un clone di cellule, ovvero un gruppo di cellule che hanno tutte origine da un’unica cellula madre, che saranno tutte identiche tra loro e all’interno delle quali ci saranno numerose copie della molecola di DNA ricombinante.

Quindi sostanzialmente il clonaggio del DNA consiste nella separazione di uno specifico gene rispetto a quella che è la sua sede naturale, ovvero il cromosoma, con lo scopo di ottenere migliaia di copie del gene in questione. Quindi clonare, di fatto, significa amplificare in maniera selettiva un gene o in generale un frammento di DNA.

Il clonaggio genico è fondamentale poiché ci consente di studiare nel dettaglio le proprietà e le funzioni di un gene di nostro interesse. Tuttavia in alcuni casi il frammento di DNA da clonare può trovarsi in una miscela di molti frammenti diversi, che può essere anche costituita da tutti i geni di un organismo. Quindi in questo caso le diverse molecole di DNA vengono tagliate in maniera precisa e riproducibile e dopo aver analizzato le dimensioni dei frammenti di DNA ottenuti mediante gel elettroforesi, ciascuno di essi è inserito in una diversa molecola di DNA vettore, mediante l’intervento delle ligasi. Per cui si ottiene una miscela di molecole di DNA ricombinante delle quali solo una contiene il gene di nostro interesse. A questo punto ogni cellula ospite riceve una sola molecola di DNA ricombinante, per cui in seguito alla replicazione delle diverse cellule ospite, ogni clone ottenuto possiederà molte copie di una sola molecola di DNA ricombinante. A questo punto il gene è isolato in modo da poter essere studiato, per cui la chiave per il successo o per il fallimento di un esperimento di clonaggio risiede nella capacità di individuare il clone che contiene il gene di interesse in mezzo a tutti gli altri. Un’operazione di questo tipo può sembrare banale per organismi come E. coli, che hanno più di 4000 geni, ma diventa impossibile metterla in atto per cellule animali e vegetali, in cui è presente un elevato numero di geni. Tuttavia esistono delle strategie che permettono di isolare il gene clonato di nostro interesse e tutte le informazioni in esso contenute.

Il clonaggio genico ha avuto applicazioni importanti in tutti i campi della ricerca biologica ed in particolare molti progressi ottenuti in campo biotecnologico sarebbero stati impossibili senza le tecnologie del DNA ricombinante. Infatti, anche se la produzione di molecole utili da parte di organismi viventi è da molti anni utilizzata (es. antibiotici), è solo grazie al clonaggio dei geni che ora è possibile far produrre ad un batterio una proteina umana. Il clonaggio genico è stato, inoltre, molto importante nell’ambito dell’agricoltura e in ambito medico. Ad esempio:

• È stata sviluppata la capacità di diagnosticare malattie genetiche dovute a mutazioni puntiformi, come ad esempio la talassemia.
• È possibile pensare a cure di determinate malattie mediate dall’utilizzazione di proteine ricombinanti prodotte all’interno di sistemi adatti.
• È possibile ottenere piante resistenti all’attacco degli insetti e a stress ambientali di tipo abiotico.
• È possibile produrre anticorpi e vaccini nelle piante.

Alla fine degli anni 80 è entrata nell’uso comune la PCR, ovvero una tecnica che è possibile utilizzare in alternativa al clonaggio classico solo nel caso in cui si abbiano delle nozioni specifiche relative alla sequenza genica che dobbiamo isolare. Infatti, dopo aver denaturato la doppia elica della porzione di DNA a sequenza nota, introduciamo nella miscela di reazione 2 primer (o inneschi), ovvero 2 oligonucleotidi complementari a specifiche porzioni su questi 2 filamenti di DNA e che pertanto si appaiano ad essi. Talvolta possiamo fare questa operazione anche quando non abbiamo la sequenza del gene da clonare, conoscendo ad esempio la sequenza di un gene di una specie molto vicina a quella presa in esame, utilizzando una miscela di primer con diverse combinazioni.

I vettori

Il vettore ha un ruolo centrale nel clonaggio, infatti serve a trasportare il DNA che noi aggiungiamo e quindi deve avere la capacità di entrare nella cellula ospite e di replicarsi in maniera autonoma al suo interno. Per far si che ciò avvenga il vettore deve possedere diverse caratteristiche:

• Deve avere dimensioni piuttosto ridotte, idealmente inferiori alle 10 kb, dato che le molecole di DNA molto grandi tendono a rompersi durante i passaggi necessari al loro isolamento e sono comunque difficili da manipolare.
• Deve essere identificabile e pertanto su di esso devono essere presenti dei caratteri fenotipici rilevabili, in modo da conferire alla cellula ospite delle caratteristiche che essa non ha se non dopo che il vettore è entrato al suo interno.
• Deve essere dotato di una serie di siti unici di restrizione che possono essere utilizzati per introdurre al suo interno il DNA esogeno. È importante che questi siti di restrizione si trovino all’interno di geni che sono in grado di conferire fenotipi riconoscibili alla cellula ospite, in modo da poter distinguere le cellule non ricombinanti da quelle ricombinanti, che a causa dell’introduzione di DNA esogeno perdono un determinato carattere fenotipico.

Abbiamo due sistemi versatili che sono in grado da fungere da vettori, ovvero i plasmidi e i cromosomi virali. Da queste 2 molecole naturali, inoltre, mediante vari tipi di manipolazione sono stati prodotti tutta una serie di vettori con caratteristiche differenti.

Plasmidi

I plasmidi sono delle molecole di DNA circolare a doppio filamento in grado di replicarsi autonomamente rispetto al cromosoma batterico all’interno delle cellule batteriche, poiché possiedono una sequenza di DNA che ricopre la funzione di origine di replicazione. Tuttavia alcuni plasmidi, detti episomi, sono anche in grado di integrarsi nel cromosoma batterico e duplicarsi con esso per numerosi cicli di divisione cellulare, ma dopo un certo numero di generazioni si liberano per ritornare degli elementi genetici indipendenti. Inoltre i plasmidi possiedono uno o più geni in grado di conferire caratteri utili al batterio che li contiene, tra cui ad esempio: la resistenza ad un antibiotico, la capacità di metabolizzare molecole inusuali come gli idrocarburi e la capacità di indurre la formazione di un tumore nelle piante come nel caso di Agrobacterium. In laboratorio questi caratteri vengono utilizzati come marcatori di selezione, al fine di assicurare che i batteri presenti nella coltura contengano un determinato plasmide, in base alla presenza o assenza della funzione specifica portata dal gene del plasmide in questione. Nello specifico per verificare la presenza del plasmide, esso si pone in presenza della cellula batterica, in modo che entri al suo interno e si aggiunge al terreno di coltura un sistema di selezione, ad esempio un antibiotico. In queste condizioni cresceranno solo le cellule che hanno acquisito il plasmide sul quale è contenuta l’informazione, e quindi solo le cellule trasformate.

Dimensioni e numero di copie

I plasmidi variano enormemente per numero di copie e dimensioni.

• I plasmidi hanno dimensioni che variano da circa 1 kb per i più piccoli fino a oltre 250 kb per i più grandi. I plasmidi di piccole dimensioni utilizzano per la propria replicazione gli enzimi prodotti dalla cellula ospite. Infatti il plasmide essendo piccolo porterà un numero limitato di cromosomi, l’origine di replicazione, il gene che conferisce la resistenza ad un antibiotico e qualche t-RNA e pertanto gli enzimi necessari alla replicazione non possono essere sintetizzati dal DNA plasmidico. Se, invece, il plasmide è molto grande può contenere geni che codificano per enzimi specifici per la sua replicazione. Tuttavia i plasmidi più frequentemente utilizzati sono quelli di piccole dimensioni, inferiori alle 10 kb, poiché sono più facilmente manipolabili ed in grado di replicarsi in un numero di copie elevato all’interno della cellula ospite. Tra i plasmidi piccoli abbiamo quello di E. coli, tra quelli grandi abbiamo il plasmide Ti di Agrobacterium, che è grande tra le 200 e le 250 kb.
• Il numero di copie si riferisce al numero di molecole di un determinato plasmide presenti all’interno di una singola cellula batterica ospite. Il numero di copie è correlato alle dimensioni del plasmide: i plasmidi di grandi dimensioni si replicano in maniera coordinata con il cromosoma batterico e per questo mantengono un numero limitato di copie all’interno della cellula batterica (1 o 2), si dicono cioè sottoposti a controllo stringente. I plasmidi di piccole dimensioni, invece, spesso sono presenti in copie multiple (fino a 1000 copie), poiché possono replicarsi in maniera indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a controllo rilassato.

Attualmente abbiamo una vasta gamma di plasmidi costruiti in laboratorio da poter utilizzare come vettori a seconda delle nostre esigenze, tenendo in considerazione anche il numero di copie massime che un plasmide può raggiungere. Il primo vettore costruito a partire da plasmidi naturali è stato Pbr 322, il quale ha un numero di copie piuttosto basso. Pbr 322 è stato poi superato dai vettori Puc che arrivano ad un numero di copie che è 10 volte superiore rispetto a quello dei vettori della famiglia Pbr. Il numero di copie non è una caratteristica casuale ma è molto controllata, cioè un plasmide non può variare il proprio numero di copie, se non modificando determinate sequenze che si trovano vicino all’origine di replicazione.

Nello specifico il numero di copie è regolato dal controllo della replicazione a vari livelli:

• Uno dei livelli di controllo è la disponibilità di primer, che sono necessari per innescare la replicazione del DNA plasmidico. Il DNA plasmidico è un DNA che si replica, come tutti i DNA, ad opera della DNA polimerasi, che come tutte le DNA polimerasi ha bisogno di un primer. Quindi è chiaro che se abbiamo a disposizione poco primer saranno poche le molecole di DNA che si replicheranno. Al contrario incrementando la quantità del primer saranno di più le molecole che si replicheranno.
• Un altro fattore limitante può essere costituito dalle proteine, in particolare dagli enzimi indispensabili per la replicazione.
• Un altro fattore di controllo è la funzionalità di queste proteine essenziali per la replicazione.

Coniugazione e compatibilità

• Alcuni plasmidi, detti coniugativi, possiedono la capacità di trasferirsi da una cellula batterica, che chiamiamo donatrice, a un’altra cellula batterica che non li possiede e che chiamiamo ricevente. Questo passaggio avviene attraverso strutture particolari, chiamate pili di coniugazione. La caratteristica di questo fenomeno è la capacità del batterio donatore di mantenere intatta una copia del proprio plasmide e di trasferire all’interno del plasmide ricevente un’altra copia.

• Esiste la possibilità che all’interno dello stesso batterio coesistano plasmidi differenti. E. coli, ad esempio, ha grande facilità di acquisire plasmidi dall’esterno e di riuscire a mantenere questa convivenza tra plasmidi (fino a 7 plasmidi differenti). La convivenza però è strettamente correlata all’attitudine che hanno questi plasmidi a convivere, cioè alla loro compatibilità. Ci sono plasmidi compatibili, che possono coesistere all’interno della stessa cellula, e plasmidi incompatibili, che nel momento in cui accidentalmente si ritrovano all’interno della stessa cellula non potendo coesistere si autoregolano con l’eliminazione di uno dei due. Di conseguenza, in base alla capacità di plasmidi differenti di coesistere all’interno della stessa cellula, è possibile identificare diversi gruppi di incompatibilità. Plasmidi appartenenti allo stesso gruppo di incompatibilità possiedono la stessa origine di replicazione e di conseguenza entrano in competizione per l’acquisizione di molecole presenti nella cellula ospite utili per la replicazione, come la DNA polimerasi, l’RNA polimerasi DNA dipendente, l’RNasiH, ecc. Quindi la competizione porta alla perdita di uno dei due plasmidi nell’ambito di due o massimo tre divisioni cellulari del batterio ospite. Se, invece, le origini di replicazione sono diverse e quindi i plasmidi utilizzano molecole differenti della cellula ospite per la loro replicazione, non c’è competizione. In questo caso i plasmidi appartengono a diversi gruppi di incompatibilità e possono coesistere all’interno della cellula.

Specificità d’ospite

La specificità d’ospite è una caratteristica dei plasmidi e può essere molto ristretta o piuttosto ampia. Alcuni plasmidi, infatti, possono replicarsi in un numero limitato di specie batteriche, mentre altri, detti a largo spettro d’ospite, sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche. I plasmidi a largo spettro d’ospite, infatti, possiedono geni per il riconoscimento dell’origine di replicazione e questo li rende più indipendenti dall’apparato replicativo dell’ospite batterico e quindi più versatili.

Quindi facendo il punto della situazione possiamo dedurre che l’origine di replicazione regola il numero di copie, definisce i gruppi di incompatibilità e definisce la specificità d’ospite.

Plasmidi in organismi diversi dai batteri

Sebbene i plasmidi siano estremamente diffusi tra i batteri, sono raramente presenti in altri organismi. Il plasmide eucariotico meglio caratterizzato è il cosiddetto plasmide ²µm, isolato da ceppi diversi del lievito Saccharomyces cerevisiae e così denominato a causa delle dimensioni del suo diametro. Questo plasmide ha consentito la produzione di tutta una serie di vettori specifici per le cellule di lievito e ampiamente utilizzati in ambito biotecnologico, in particolare per stimolare la produzione da parte delle cellule di lievito di grandi quantità di proteine ricombinanti. Si ha quindi il vantaggio operare in un sistema eucariotico, ma con la semplicità specifica di un sistema procariotico.

Classificazione dei plasmidi

I plasmidi presenti in natura vengono classificati in base alle proprietà dei loro geni in 5 classi:

• I plasmidi della fertilità, detti plasmidi F, promuovono la coniugazione, grazie alla presenza di geni tra, che consentono il trasferimento del DNA plasmidico dalla cellula donatrice alla ricevente.