Genetica e tecnologie genetiche

Contiene

• La nascita della genetica [Mendelismo (3 leggi con spiegazione)- genetica mendeliana negli organismi (esperimento di Bateson) e nell’uomo- ereditarietà autosomica dominante e recessiva dell’ereditarietà- teoria cromosomica- mitosi e meiosi (con spiegazione interferenza e crossing over)- sistemi cromosomici degli organismi viventi- eredità citoplasmatica- segregazioni anomale dei fenotipi [interazione fra geni, esperimenti di Beadle e Tatum (un gene-un enzima), poliallelia, dominanza incompleta, codominanza, alleli letali]- associazione [Bateson e Punnet, Morgan e ricombinazione, mappe di associazione]- analisi delle tetradi ordinate- genetica batterica e dei virus (fago T4 e fago lambda)- coniugazione batterica- trasduzione- trasformazione- plasmidi- genetica dei batteriofagi (Benzer)- il DNA [esperimenti di Griffith, Avery, MacLeod, McCarthy e Harsey e Chase; struttura del DNA (Franklin, Chagraff, Watson e Crick), replicazione del DNA (Meselson e Stahl), strutture alternative del DNA, sintesi in vitro del DNA (Kornberg), telomeri]- espressione dei geni [trascrizione, promotori, segnali di inizio e termine trascrizione, maturazione dei trascritti]- traduzione [colinearità gene-proteina (Yanowsky), scoperta del codice genetico (Crick, Brenner, Niremberg, Matthaei), anemia falciforme, tRNA, rRNA, mRNA, ribosomi]- mutazioni cromosomiche (strutturali e numerali) e geniche [mutazioni somatiche e germinali, mutazioni somatiche e cancro, sistemi di selezione, mutazioni in assenza di selezione (test di fluttuazione, Luria e Delbruck), meccanismi di insorgenza delle mutazioni, mutazioni puntiformi e indel, mutazioni spontanee o indotte, mutazioni indotte da trasposoni, mutazioni soppressive (intrageniche e intergeniche)] regolazione dell’espressione genica nei procarioti [controllo positivo- negativo, Jacob e Monod, operone Lac, mutazioni lac in cis e trans, lisogenia (operone fago lambda), operone trp, operone ara, cenni RNA antisenso e riboswitch]- cenni regolazione genica negli eucarioti (fattori di trascrizione, interferenza dell’RNA)- terminologia genetica.

Biotecnologie

• Enzimi di restrizione
• Vettori
• Clonaggio
• Strategie di selezione
• Elettroforesi
• Replica plating
• PCR
• Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)
• Librerie di DNA

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La nascita della genetica

La genetica è la scienza che studia i fenomeni dell’eredità e della variabilità biologica. Il nome è stato dato da W. Bateson nel 1906, ma la disciplina esisteva già anteriormente ed era chiamata “scienza dell’ereditarietà”.

Nell’Ottocento esisteva una visione comune chiamata “teoria della mescolanza”, secondo cui l’ereditarietà funzionasse come una miscelazione di fluidi.

Si basava su due presupposti fondamentali, di cui uno si è rivelato corretto mentre l’altro errato:

• I due genitori danno un uguale contributo alle caratteristiche della prole (presupposto corretto);
• Nella prole i fattori ereditari si mescolano (presupposto errato).

I caratteri nella progenie sono:

• Simili
• Intermedi
• Non sembrano essere ereditati

Modello ereditarietà per mescolamento = caratteristiche intermedie sono trasmesse alle generazioni future con continuo mescolamento, perciò la variabilità viene cancellata nel tempo e il fenotipo sarà uguale per tutti gli individui.

Modello ereditarietà particolata = la progenie è data da una combinazione di caratteri dei genitori. Il contributo dei singoli genitori viene trasmesso come entità separata, dunque la variabilità viene mantenuta nel tempo.

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Gregor Mendel, monaco agostiniano che viveva a Brno (attuale Repubblica Ceca), nel 1865 pubblicò i risultati di varie sperimentazioni in un lavoro dal titolo "Esperimenti sull'ibridazione delle piante". Questi studi, condotti nell'arco di otto anni, permisero di formulare le leggi che stanno alla base dell'ereditarietà.

• Dimostrò come i genitori trasmettono ai figli i fattori ereditari discreti da una generazione all’altra, e che mantengono la propria individualità, che indipendentemente da come sono mescolati, mantengono sempre la propria identità. Giunse alla conclusione che i caratteri ereditari fossero “discreti”, cioè delle unità finite e distinte, proponendo quindi un modello di ereditarietà particolata.

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Esperimento di Mendel

Fece riprodurre per impollinazione crociata o per autoimpollinazione diverse varietà di piante di pisello odoroso (Pisum sativum).

Ma perché scelse proprio il Pisum sativum?

• È facile da coltivare
• Permetteva il controllo della fecondazione e/o l’autofecondazione
• Ha fenotipi facili da distinguere visivamente (colore di semi, baccelli e fiori; forma dei semi e dei baccelli; posizione del fiore assiale o terminale; altezza della pianta)

Uno dei suoi esperimenti riguardò l’incrocio di una varietà di fiori viola con fiori bianchi.

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Osservò che la prima generazione ibrida aveva solo fiori viola (non c’è mescolanza).

Poi autoimpollinò la prima generazione di piante ibride, in modo da far crescere una seconda generazione, e notò piante sia con fiori viola che bianchi.

Osservazioni

Notò che c’erano 3 piante viola per ogni 1 pianta a fiori bianchi (rapporto 3:1).

Conclusione

• I geni si comportano come particelle che non si mescolano tra loro
• Un allele è dominante sull’altro

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Propose che i fattori che controllano i caratteri si comportano come particelle (e non fluidi) che non si mescolano tra loro, ma vengono trasmesse intatte alla generazione successiva.

Oggi queste “particelle” prendono il nome di geni.

Ogni pianta ha 2 copie del gene che controlla il colore del fiore in ognuna delle cellule del corpo della pianta (cellule somatiche). Tuttavia quando la pianta produce gameti, in queste cellule entra solo una copia del gene. Quando poi l’uovo e lo sperma si fondono ecco che nelle cellule somatiche sono presenti due copie del gene del colore del fiore.

Mendel propose anche che il gene per il colore del fiore esistesse in due varianti genetiche o alleli, una che condiziona i fiori viola, l’altra i fiori bianchi. Indicò anche dominante l’allele viola del gene, mentre recessivo l’allele bianco.

Una pianta con un allele viola e uno bianco avrebbe avuto fiori viola. Due piante con alleli bianchi avrebbero avuto fiori bianchi.

Geni => esistono in diverse versioni (alleli)

Alleli => forme alternative dello stesso gene che determinano modalità alternative dello stesso carattere

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Differenti alleli (R-r) di un determinato gene occupano stesso locus su cromosomi omologhi.

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Focus

Le proprietà biologiche di una specie sono denominate caratteri o tratti.

I caratteri ereditari sono specifici tratti di DNA, i geni, che contengono le informazioni per la sintesi delle proteine.

Tutta la genetica è basata su varianti: gli individui ereditano un tratto che si esprime in modo diverso da una forma standard.

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La forma selvatica o wild type è la forma più comune che si trova in natura.

Genotipo: indica la costituzione in geni di un individuo, ovvero il suo patrimonio di caratteri ereditari.

Fenotipo: espressione finale, visibile, delle caratteristiche geniche.

I legge della dominanza

Mendel isolò per ogni carattere una linea pura che rappresentano le linee parentali pure (P).

Linee pure = piante che se incrociate o autofecondate [autoimpollinate: far cadere polline di un fiore sullo stesso stigma] tra loro producono solo piante con caratteristiche identiche a quelle dei genitori.

➔ Linee pure per colore del seme:

Successivamente incrociò le piante che mostravano i due caratteri antagonisti.

Ciò viene detta impollinazione incrociata e porta alla formazione degli ibridi.

Sulle piante che risultavano da questa impollinazione, cioè la prima generazione filiale (F1), Mendel vide che si manifestava un solo carattere.

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➔ La generazione F1 era composta da piante tutte uguali con piselli gialli (fenotipo dominante):

Successivamente incrociò tra loro le piante della generazione F1 e ottenne la generazione F2 composta per ¾ da piante con piselli gialli (di cui 1/3 quando fecondate davano tutti semi gialli e 2/3 quando fecondate davano per ¾ semi gialli e ¼ semi verdi) e per ¼ da piante con piselli verdi.

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Notò che c’era un rapporto matematico 3:1 tra giallo e verde.

N.B. il fenotipo che si manifesta sempre è dominante, mentre quel fenotipo che non si manifestava nella F1, ma che era ricomparso nella F2 viene detto recessivo.

Conclusione

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Dall’incrocio tra due linee pure che differiscono per un solo carattere, si “ottiene una F1 in cui gli individui manifestano uno solo dei due fenotipi parentali, detto dominante”.

In realtà alla F2 non si presentava un rapporto di 3:1, ma di 2.96:1!!

Test del chi-quadrato (χ²)

Serve per verificare se le frequenze osservate in una o più categorie corrispondono a quelle attese.

χ² = ∑[(O − A)² / A]

Esempio:

Lisci -> O: 5474 A: 5493

Rugosi -> O: 1850 A: 1831

χ² = 0,263

Grado di libertà (GL): N-1 = 2-1 = 1

Dove N è il numero di classi fenotipiche (in questo caso 2: liscio e rugoso)

P > 0,05 => dovuto al caso

P < 0,01 => alta significatività statistica

0,01 < P < 0,05 => potrebbe essere dovuto al caso

II legge della segregazione

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“Durante la formazione dei gameti la segregazione di una coppia di alleli di un gene è indipendente dalla segregazione degli alleli di un altro gene”.

A questo punto auto-incrociò tra loro le piante della generazione F2, ottenendo la generazione F3: le piante della generazione F2 con piselli gialli si comportavano per 1/3 come la linea pura parentale gialla per 2/3 come la F1 (con un rapporto gialle/verdi 3: 1), mentre le piante con piselli verdi si comportavano tutte come la linea parentale verde.

F3:

• ¼ linee pure verdi bb
• 1/3 linee pure gialle AA
• 2/3 gialli eterozigoti Ab

Il rapporto è 1:2:1

N.B. ogni individuo possiede due fattori, geni, uno ereditato dal padre e uno dalla madre, che determinano ogni carattere.

Questi a loro volta si separeranno (segregazione) alla formazione dei gameti, cellule che contengono uno solo di questi fattori (alleli).

In un uovo fecondato, la prima cellula che si svilupperà si chiama zigote. Una pianta con una coppia di alleli identici è detta omozigote, mentre se ha due alleli diversi è detta eterozigote o monoibrido.

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Un individuo può essere classificato:

• Omozigote dominante: Y/Y
• Omozigote recessivo: y/y
• Eterozigote: Y/y (monoibrido)

➔ Queste combinazioni alleliche in base al fenotipo (Y/Y, y/y, Y/y) sono chiamate genotipi.

III legge dell’assortimento indipendente

“Gli alleli di caratteri diversi si distribuiscono nei gameti indipendentemente l’uno dall’altro”.

L’incrocio forma individui diibridi (ibridi per due caratteri): GgLl

Il modo migliore per mostrare graficamente i risultati dell’incrocio è la griglia 4 x 4, chiamata quadrato di Punnet.

Al fine di ottenere un rapporto 9:3:3:1

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Terminologia

• Aploide: n tutti i geni presenti in una sola coppia. Gli organismi aploidi, come le muffe, i lieviti e alcune alghe, trascorrono quasi tutta la loro vita allo stato aploide (ciclo aplonte)
• Diploide: 2n tutti i geni presenti in due spore (es. cellule somatiche di animali e alcune piante). Solitamente gli organismi diploidi (animali) sono organismi che trascorrono quasi tutta la vita allo stato diploide (ciclo diplonte). Esistono organismi che alternano generazioni aploidi con diploidi (ciclo aplodiplonte) come ad esempio l’Ulva lactuca
• Autosomi: cromosomi che non partecipano alla determinazione del sesso di un individuo (portano informazioni genetiche che riguardano essenzialmente i caratteri somatici)
• Eterosomi: cromosomi sessuali
• Dominanza incompleta: non sempre i caratteri presentano proprietà nette di dominanza e recessività. Alcune volte l’eterozigote può presentare caratteristiche intermedie tra i due fenotipi omozigoti.

Un esempio è la pianta bella di notte (Mirabilis Jalapa): l’incrocio tra la varietà rossa e quella bianca produce fiori ibridi intermedi di colore rosa.

Ottenendo due eterozigoti dal loro incrocio si avrà un rapporto genotipico pari a: 1:2:1 e fenotipico: 1 viola, 2 rosa e 1 bianco.

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• Codominanza: è l’espressione di entrambe gli alleli di un eterozigote.

Un esempio sono i gruppi sanguigni AB0. Questo è determinato dalla codominanza di tre alleli degli antigeni: Ia, Ib, i.

• Alleli letali recessivi: che causano la morte dell’organismo.

Lucien Cuénot riuscì a isolare dei topi con il mantello di un colore atipico: giallo.

Solitamente i topi (nello stato selvatico) hanno un mantello grigio/nero (Y).

La condizione di omozigosi dell’allele mutato, ovvero Yy /Yy è letale per l’organismo.

L’incrocio di topo giallo (Ay) x topo giallo (Ay)

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Il rapporto fenotipico anomalo è di 2:1

• Geni subletali: determinano la comparsa di anomalie compatibili con la vita. Gli individui muoiono nei primi periodi di vita.

Ad esempio l’assenza di piumaggio nei pulcini

Poliallelia

Poliallelia = un gene presenta alleli multipli.

• Esempio: colore del pelo nei conigli.

In condizione di omozigosi ogni allele determina un certo fenotipo.

C+ = wild type (è cioè è funzionale)

C- = alleli mutanti (hanno subito una mutazione durante l’evoluzione del coniglio ipomorfo,

• Cch = chinchilla (parzialmente ipomorfo)
• Ch = himalayano (parzialmente ipomorfo)
• cc = albino (amorfo = non funzionale)

Relazione di dominanza: c+ > Cch > Ch > c

Un gene - un enzima

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Beadle e Tantum lavorarono sulla Neurospora (fungo aploide).

Ipotizzarono che l’espressione di un gene sotto forma di fenotipo potesse avvenire tramite un enzima (vinsero premio Nobel nel 1958 per questo).

Sottoposero la Neurospora a un trattamento con raggi X, i quali agiscono da agenti mutageni (provocando mutazioni).

Quando esaminarono le colture, trovarono che alcuni ceppi mutanti non erano più in grado di svilupparsi sul terreno minimo (acqua, sali minerali e fonte di carbonio: prototrofico), ma necessitavano l’aggiunta di una sostanza nutritiva. Questi mutanti auxotrofi avevano subito mutazioni nei geni che codificano gli enzimi per sintetizzare quelle sostanze nutritive.

Per ciascun ceppo riuscirono a individuare il composto che, aggiunto al terreno minimo, basta a sostenere la crescita.

Da ciò si dedusse che le mutazioni avessero un effetto semplice e che ogni mutazione danneggiasse solo un enzima della via metabolica.

Successivamente si scoprì che non solo gli enzimi, tutte le proteine, sono codificate da geni, perciò fu ridefinita: un gene - un polipetide (unità più semplice di proteina, formata da una singola catena amminoacidica).

-> Oggi conosciamo un centinaio di esempi di malattie ereditarie nelle quali un gene difettoso determina un errore nella produzione di un enzima specifico (es. PKU).

Interazioni tra geni

In alcuni casi un gene può interagire con altri geni per controllare la manifestazione di un unico carattere.

• Il classico esperimento che dimostra l’interazione tra geni è quello di Bateson e Punnett (1905), in cui vennero incrociati polli che differivano per la forma della cresta (a rosa x a pisello).

In F1 si ottennero tutti polli con cresta a noce (o Walnut), un fenotipo nuovo. Poteva trattarsi di un semplice caso di codominanza, con la comparsa di un carattere intermedio.

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Ma incrociando gli ibridi F1 si ottennero polli con 4 tipi di creste: 9:3:3:1 (9 a noce, 3 a pisello, 3 a rosa, 1 semplice).

La distribuzione delle creste 9:3:3:1 suggeriva che il carattere ‘forma della cresta’ fosse controllato non da uno, ma due geni secondo il seguente schema:

• ➔ L’allele R da solo determina la cresta a rosa ed è dominante su r
• ➔ L’allele P da solo determina la cresta a pisello ed è dominante su p
• ➔ R e P sono codominanti e la loro presenza congiunta determina la comparsa della cresta a noce
• ➔ rrpp determina la comparsa della cresta semplice

Nella scrittura R_ il trattino significa che il genotipo può essere indifferentemente RR o Rr.

Nella scrittura P_ il trattino significa che il genotipo può essere indifferentemente PP o Pp.

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• Esistono diversi tipi di interazioni tra geni:

Epistasi

1. Epistasi: termine che significa “stare sopra”. È un fenomeno di dominanza intergenica, in cui un gene si manifesta “coprendo” la manifestazione di un altro gene che rimane inespresso.

Il gene che maschera la mutazione è detto epistatico, mentre la mutazione mascherata è detta ipostatica.

➔ Epistasi recessiva: l’agente epistatico è un gene in forma omozigote recessiva.

• Il rapporto fenotipico caratteristico incrociando due diibridi è 9:3:4
• Se ne ha un esempio nel colore del mantello del topo con i due geni