Tecnologia NGS analisi DNA

Misincorporation: C-->T è un segnale che ci

permette di riconoscere il DNA antico da quello

moderno, che non ha queste caratteristiche.

La citosina, a causa della deaminazione, diventa

uracile; U al primo ciclo di amplificazione diventa

adenina e al secondo timina→ C verso T.

L’adenina per deaminazione diventa ipoxantina,

che viene letta dalla TAC polimerasi come

citosina, che viene a sua volta letta come

guanina→ A verso G.

Segnali tipici di DNA degradato

 Ci siamo accorti di questo andando ad

analizzare il DNA mitocondriale

neandertaliano: presentava alle

estremità 3’ e 5’ tanti errori: perché? Ci

sono questi errori perché quando

costruiamo una libreria questa non è

pari, quindi interviene la T4 DNA

polimerasi che la va a ricostruire. Poi

durante l’amplificazione questi errori

vengono amplificati, e quindi

osserviamo le C-->T che ci permettono

di dare un segnale di antichità al nostro

reperto. Tutto ciò si fa con il software MapDamage durante il contamination check nel

workflow dell’NGS. Le caratteristiche della degradazione sono:

piccole quantità, frammentazione e mis-

incorporazioni.

Per evitare contaminazioni da parte del DNA

esogeno, dobbiamo sviluppare un

comportamento appropriato quando

andiamo a recuperare campioni. Si sviluppa

un approccio metodologico particolare

(analisi con mascherina e guanti per

eliminare contaminazioni attuali) e si lavora in

situazioni che permettono di evitare

contaminazioni. I segnali di danno sono molto

utili al fine di poter capire se si tratta di DNA autentico oppure no.

Quali sono i due differenti approcci che

andiamo a sviluppare per studi sul DNA antico

o degradato?

1) Approccio classico

2) Approccio NGS: primo step +

secondo step (prima e seconda

generazione).

Oltre ai differenti tipi di workflow e a questi

due approcci, è importantissimo tenere

conto del distretto osseo da cui noi andiamo

72

a sviluppare le analisi, perché a seconda del distretto si ottengono risultati più o meno

buoni. Ad esempio, i distretti ossei come la rocca petrosa o un dente, ci danno sicuramente

migliori risultati rispetto ad altri distretti ossei che portano a risultati scadenti.

Dobbiamo anche chiederci che tipo di studio vogliamo fare: se vogliamo studiare una

paleopatologia o una patologia, come la peste bubbonica, dobbiamo vedere se

nell’individuo morto ci trovo ancora il batterio Yersinia pestis. Questo lo trovo più facilmente

se analizzo il DNA proveniente da un dente piuttosto che dalla rocca petrosa; in particolare,

per identificare la patologia utilizzo il