Analisi DNA con tecniche bioinformatiche

NovaSeq: da 1800Gb riusciamo a fare dalle

2400 alle 3000 Gb in circa 45 ore.

A seconda di quante Flow Cell e del tipo di

kit (come SP, S1, S2 e S4) che utilizziamo,

abbiamo un output diverso (65, 134, 333 o

2400 Gb).

SEQUENCING Nella terza fase, Sequencing by Synthesis) abbiamo le

4 basi che sono attaccate ad un fluoroforo. A seconda

della base che viene inserita, viene rilasciato il colore→

riusciamo a rilevare il segnale.

Il primo ciclo prevede:

Aggiunta del reagente di sequenziamento

➢ Incorporazione della prima base

➢ Rimozione delle basi non incorporate

➢ Rilevamento del segnale

➢

Dal secondo ciclo in poi si aggiunge il reagente di

sequenziamento e si ripete: si fanno tanti cicli finché non

abbiamo sequenziato tutte le reads presenti nella flow

cell o nei clusters.

La flow cell è una lane di tile, che è densa di primers in

cui si sviluppa il sequenziamento. Il sequenziamento può essere fatto:

a) in singled-end= sequenziamento solo

in forward; 1 read per frammento di

DNA. È il metodo più semplice ed

economico che viene utilizzato con

Illumina.

b) in paired-end= il frammento di DNA

viene sequenziato sia in forward che in

reverse; abbiamo 2 reads per

frammento. È più costoso, ma permette

un miglior allineamento delle reads→

siamo capaci in maniera più

consapevole e precisa di andare ad osservare riarrangiamenti (come delezioni,

inserzioni e inversioni); è quello che usiamo per le analisi genomiche su DNA

degradato. 61

Densità di ciascun cluster:

a) Underclustered= troppo poco DNA

b) Overclustered= ne abbiamo messo

troppo

c) Optimal Clustering= soluzione ottimale

in cui riusciamo a leggere tutte le

reads senza fare confusione

Questa densità dipende dalla

concentrazione delle librerie, dei pool di

librerie che carichiamo. Bisogna quindi fare

delle misurazioni attente per poter inserire il

giusto quantitativo di DNA.

Come si riesce a sviluppare un workflow

che riguarda le NGS

Si parte da una libreria, che proviene da

un campione che io ho estratto; su

questo ho costruito, ad esempio, la

libreria ds. Siccome nella libreria ho

messo degli indici, posso mescolare più

librerie insieme per avere un pool che

sequenzio tutto insieme.

Sulla libreria posso fare un TARGET

ENRICHMENT= vuol dire bersaglio che

vado ad arricchire per poi essere

analizzato. Quale può essere il target

enrichment che facciamo? Possiamo farlo sul DNA, quindi una Mt DNA capture: con cosa

la facciamo? Con la PEC (Primer Extension Capture) oppure con la metodologia Maricic

(prendo il mitocondrio, lo amplifico 2 volte con due long range PCR, frammento e poi metto

la biotina e la streptavidina--> con le biglie magnetiche vado a catturare ciò che mi

interessa). Arricchire vuol dire amplificare, aumentare il numero di copie del target che

voglio recuperare; dopo aver amplificato sequenzio.

Se faccio Mt DNA capture posso utilizzare due sequenziatori (= MiniSeq e MiSeq) perché

vado a sequenziare in paired-end con dei frammenti abbastanza corti, e n