Appunti di Botanica generale sul DNA antico

Quando andiamo ad analizzare del DNA con

l’NGS 2, cioè analisi di NGS di seconda

generazione, sappiamo che il nostro DNA

contiene sia DNA endogeno che esogeno.

Ricordiamoci che quando si parla di DNA

endogeno si parla di DNA che, quando viene

mappato, mappa sul DNA umano; ma questo

DNA che mappa sul DNA umano non è tutto

endogeno: semplicemente mappa sul DNA

umano, poi per sapere se è totalmente

endogeno dobbiamo andare a vedere la

frammentazione e C-->T.

Sappiamo anche che il nostro DNA ha un basso

numero di copie ed è frammentato in piccole molecole; fortunatamente ha la

degradazione alla fine delle molecole che ci permette di distinguere il DNA endogeno vero

da quello non vero. Sul DNA estratto posso preparare le

librerie ss o ds; le ds library possono

essere non trattate, oppure avere un

UDG treatment oppure un parziale

trattamento con UDG. Cosa è

questo trattamento? UDG è la

molecola che ci permette di

eliminare le C-->T. Perché le elimino?

Perché se voglio fare uno studio di

carattere filogenetico e ho un sacco

di mis-incorporazioni in mezzo alla

molecola, queste mi fanno saltare lo

studio di carattere filogenetico (perché queste mutazioni in realtà non ci sono). Se utilizzo

UDG al 100% perdo anche i segnali al 5’ e al 3’; se utilizzo il trattamento half UDG al 5’ e al

3’ rimangono le mis incorporazioni, mentre mi scompaiono in mezzo alla catena→ così ho

delle sequenze che posso studiare in maniera sicura.

Come si fa la libreria su Illumina: blunt end repair→adapter ligation→ adapter fill-in→

indexing PCR.

La degradazione alla fine delle molecole

ci permette di distinguere DNA endogeno

da DNA non endogeno.

In un trattamento senza UDG, nel DNA

antico le mis-incorporazioni raggiungono il

35%. Se avessi trattato lo stesso campione

con half UDG, probabilmente le mis-

incorporazioni sarebbe intorno al 16-20%. 77

Sappiamo anche che esiste un temporal

pattern di mis-incorporazioni nucleotidiche

e di frammentazione: tanto più si va

indietro nel tempo, e tanto più le mis-

incorporazioni aumentano.

Se ho un campione di 60.000 anni, mi

aspetto di avere una percentuale di mis-

incorporazioni che va dal 25% in su.

I pattern di mis-incorporazioni sono molto in

linea con l’andamento temporale, è

abbastanza difficile che non ci sia questa

correlazione. Cosa possiamo fare su una libreria?

1. Shot gun sequencing= sequenzio

direttamente con uno shot gun light

2. Target enrichment, andando a

selezionare i target che vogliamo

recuperare: quali sono? I target che

possiamo recuperare sono mitocondriali e

nucleari. Quindi li recupero con delle

catture, li arricc