Antropologia

NGS: introduzione e tecnologie

NGS si tratta di una serie di tecnologie che permettono di sequenziare genomi completi in un tempo ristretto in modo tale di ricostruire le dinamiche evolutive della nostra specie. Il termine NGS vuol dire letteralmente New generation sequencing. Questa tecnica rappresenta una vera e propria rivoluzione rispetto alla metodologia classica.

Vantaggi della tecnologia NGS

Infatti, mentre la metodologia classica poteva essere applicata solo in alcuni casi (DNA mit di individui di cui conosco la storia tafonomica ossia la storia del campione che mette in luce anche le possibili manipolazioni che questo ha subito negli anni, il DNA mit dei Neanderthal e dei Sapiens in quanto differiscono l'uno dall'altro e DNA nucleare di Neanderthal che contiene alleli ancestrali specifici per questa specie), la tecnologia NGS può essere applicata a tutti i genomi.

Infatti, con questa tecnica è possibile distinguere il DNA esogeno da quello endogeno e dunque possiamo analizzare campioni che sono stati manipolati da vari operatori e scartare quelli troppo contaminati.

Prospettiva mitocondriale e nucleare

All'interno della tecnologia NGS è presente sia una prospettiva mitocondriale che è una prospettiva nucleare, infatti oltre a poter ricostruire genomi completi, possiamo ricostruire il DNA mitocondriale traendo due principali benefici:

• Innanzitutto ricostruendo il genoma mitocondriale possiamo ricavare la storia evolutiva, anche se al femminile di una popolazione.
• Attraverso l'analisi dello stato di conservazione dei mitocondri possiamo capire anche che probabilità abbiamo di ottenere un buon DNA nucleare per capire poi come muoverci nel trattarlo.

Passaggi semplificati e maggior affidabilità

Inoltre, rispetto alla metodologia classica esistono una serie di passaggi che possono effettivamente essere molto più semplici da fare e che forniscono un'affidabilità maggiore. I problemi di questa tecnologia è che i costi sono elevati e che solo alla fine del percorso possiamo capire se i dati ricavati dal campione sono utili o meno.

Flusso di lavoro della NGS

Ad ogni modo il flusso di lavoro della NGS prevede diversi step:

Estrazione del DNA

1) Inizialmente il DNA viene estratto da reperti ossei localizzati in specifici distretti. Tra questi reperti ossei, non si utilizzano reperti postcraniali (presenti invece nella metodologia classica) ma si utilizzano la rocca petrosa che è un osso posto sotto al cranio e i denti. Estrarre il DNA dalla Rocca petrosa è un processo complesso per due motivi. Innanzitutto, poiché le rocche petrose sono attaccate al cranio, queste devono essere staccate e durante la procedura possono rompersi, inoltre una volta staccate le rocche petrose vengono divise in due parti in modo tale da estrarre il materiale genetico in una determinata zona detta punto c. Nel caso in cui il DNA venga estratto dal dente viene fatto un buco nella radice e viene prelevata la polvere d'osso. Nonostante questo processo abbia una resa minore, si preferisce estrarre il DNA dal dente in quanto è una procedura più semplice. Infatti i denti possono essere estratti e riattaccati facilmente e inoltre possono trovarsi in contesti anche molto differenti.

Degradazione e ricostruzione del DNA

2) Ad ogni modo, una volta estratto, poiché il DNA è antico è molto probabile che questo sia degradato e che abbia missincorporazioni in 5’ e 3’. Infatti, la degradazione del DNA può avvenire su tutta la molecola e a causa di diversi fattori, tuttavia in un DNA degradato, le missincorporazioni sono molto frequenti in posizione 5’ e 3’ con una prevalenza di C verso T e di A verso G. Dunque, molto probabilmente, le estremità di questa molecola non saranno piatte. Pertanto, inizialmente ricostruisco le estremità piatte in 5’ e 3’ utilizzando la Polimerasi T4 che agisce sia a destra che a sinistra del mio frammento. Una volta che la PolT4 ha reso le estremità del frammento di DNA piatte e alle estremità del frammento inserisco degli adattatori ossia degli oligonucleotidi noti (detti adattatori A e B).

Costruzione di una libreria di DNA

A questo punto ho costruito una libreria di DNA contenente tutti i frammenti di DNA presenti nell’estratto. Costruire una libreria significa rendere immortale tutto il DNA contenuto nell’estratto come DNA esogeno, DNA batterico, DNA fungino e così via. Infatti, a differenza della PCR non abbiamo uno specifico target ma, grazie alla costruzione delle librerie a DNA, otteniamo il panorama molecolare di tutto ciò che ho estratto. Una volta costruite le librerie queste possono essere lette e sequenziate mediante due tecniche: la tecnologia del pirosequenziamento detta anche 454 GS 20 o la tecnologia Illumina.

Tecnologie di sequenziamento

Tecnologia 454 GS 20

La tecnica 454 GS 20 ci ha permesso di condurre i primi studi sul genoma di Neandertal. Infatti è il primo strumento NGS che ha consentito di sequenziare grandi quantità di DNA. Nel corso degli anni il sequenziamento, nella tecnologia NGS si è passati dall’ABI Sanger (10² frammenti per corsa), al 454 GS20 (10⁵ frammenti per corsa), Illumina GA2 (10⁸ frammenti per corsa) e infine Illumina HiSeq 10⁹ frammenti per corsa.

Tecnica del pirosequenziamento o 454 GS

Nella tecnica del pirosequenziamento la libreria prima viene denaturata in modo tale da lavorare su singoli filamenti di DNA (lavoro solo con uno tanto l’altro è complementare). Successivamente, la libreria viene fatta interagire con delle microbilie che presentano sulla loro superficie degli adattatori A e B complementari a quelli presenti nei frammenti di libreria.

Il numero di microbilie impiegate varia a seconda del numero di molecole generate all’interno della libreria. Questo valore, che può essere stimato mediante la RT-PCR, è molto importante in quanto ci permette di capire quante bilie usare, ma comunque sia generalmente il numero di microbilie impiegate è superiore rispetto alla concentrazione della mia libreria. Ad ogni modo, i frammenti di librerie (rappresentati da singoli filamenti di DNA) si attaccano agli adattatori presenti sulla superficie delle microbilie e una volta attaccati questi vanno incontro a polimerizzazione. Affinché possa avvenire la polimerizzazione, le bilie, contenenti il frammento di libreria, devono essere introdotte in un ambiente particolare creato da un’emulsione.

Nell’emulsione, si verifica la cosiddetta PCR emulsio-clonale, per cui il frammento di libreria attaccato all’adattatore della bilia viene riprodotto a partire dall’adattatore, successivamente si stacca e si attacca a un altro adattatore che lo riproduce nuovamente. Questo processo dura finché sono presenti adattatori nella bilia, quando tutti gli adattatori saranno saturati dal legame con i frammenti di librerie riprodotti, la PCR emulsio clonale si interrompe, l’emulsione si rompe e le microsfere vengono inserite in piastre contenenti tanti piccoli fori detti micro-reattori.

Questi fori vengono detti micro-reattori in quanto in ciascun foro sono presenti i reagenti necessari per il pirosequenziamento. A questo punto, i microreattori vengono inseriti nella macchina adibita al sequenziamento e in ciascun microreattore il frammento di libreria che ho amplificato sulla bilia viene letto al fine di ottenere il panorama molecolare della libreria che ho generato a partire dall’estratto. Le letture ottenute da questo sequenziatore si chiamano Reads.

Dunque con il pirosequenziamento posso sequenziare il DNA amplificato ottenendo il panorama molecolare del prodotto di amplificazione e vedere la composizione di tutte le molecole che ho amplificato. Questa tecnologia può corrispondere al clonaggio della metodologia classica ma ho prodotti più ampi rispetto al clonaggio.

Utilizzo di tag

Le librerie possono essere taggate, ossia oltre agli adattatori A e B, all’interno della libreria posso inserire un frammento di DNA che è specifico per quella determinata libreria. Questo frammento di DNA agisce da tag e dunque, una volta che la libreria sequenziata è stata letta, ci permette di capire a quale campione appartiene quella specifica libreria. Taggando le librerie, è possibile quindi mescolare e sequenziare più librerie assieme in quanto ciascuna di esse ha al suo interno uno specifico tag, ossia una specifica sequenza di DNA. Infatti, quando andrò a leggere la libreria di DNA, oltre alla sequenza del frammento di DNA, leggerò anche il tag che mi permetterà di capire che quel frammento di DNA sequenziato appartiene a quella determinata libreria che ho costruito a partire da un determinato amplificato e quindi da un determinato estratto.

Grazie a questo meccanismo posso analizzare e sequenziare un numero maggiore di campioni, circa 10⁵, 10⁷ molecole sequenziate per corsa. Nel flusso di lavoro della 454 questi tag si chiamano MIT e sono circa una ventina quindi teoricamente posso processare 20 libreria insieme e andare successivamente riconoscere.

Progetto di Adrian Briggs

I tag sono stati utilizzati in un progetto condotto da Adrian Briggs finalizzato a ricostruire il genoma completo di 5 mitocondri appartenenti a 5 differenti uomini neandertaliani. Il DNA mitocondriale è lungo circa 10⁴ pb quindi se vado a sequenziare il DNA mitocondriale di un uomo posso leggere circa 100 volte ciascuna base in modo tale da avere un’informazione estremamente ampia. Utilizzando i tag abbiamo detto che possono sequenziare e leggere più DNA mitocondriali insieme in quanto ciascuno di questi verrà associato a un opportuno tag. Anche se inserisco più mitocondri insieme ho comunque una lettura del genoma molto ampia, infatti nel nostro caso leggendo 5 mitocondri avrò una profondità di lettura, ossia un numero di volte con cui può essere letto il frammento di DNA, di 20 (100:5).

Primer extention capture

Per distinguere il DNA mitocondriale da tutto il DNA che ho estratto (da un reperto osseo), Adrian Briggs ha utilizzato una tecnica nota come primer extention capture (PEC). Il principio su cui si basa la PEC è andare a catturare i frammenti di DNA della libreria che voglio sequenziare. Pertanto, dal reperto neandertaliano, è stato estratto il DNA e a partire dagli estratti è stata costruita la libreria a DNA contenente oltre agli adattatori, anche il tag. Successivamente, grazie alla PEC, i frammenti vengono selezionati, catturati e rimossi dal contesto in cui si trovano. Dunque, in questa tecnica, vengono sviluppati dei primer PEC ossia dei frammenti di oligonucleotidi con una molecola di biotina all’estremità complementari al frammento di DNA neandertaliano che voglio catturare.

Per andare a catturare tutto il DNA mitocondriale avrò bisogno di numerosi primer PEC che consentono di coprire tutta la lunghezza del DNA mitocondriale che essendo dell'uomo neanderthaliano non è più circolare ma è frammentato. Inizialmente, i primer PEC si attaccano alla zona del frammento di DNA neandertaliano a loro complementare, in questo modo un complesso dato dai primer PEC e dal frammento di DNA catturato. Successivamente, per rimuovere il frammento di DNA mitocondriale di mio interesse da tutto il contesto della libreria, utilizzo delle biglie magnetiche che presentano sulla loro superficie delle molecole di streptavidina. Queste molecole sono complementari alla biotina, pertanto si legano ad esse e si forma il complemento biotina-streptavidina. Successivamente, mediante un magnete posso rimuovere le biglie contenenti la streptavidina complessata alla biotina del primer PEC (legato al frammento di DNA di mio interesse). In questo modo posso estratte i frammenti di DNA mitocondriale di mio interesse. Questi, dopo esser stati estratti, seguiranno il flusso della 454 GS, pertanto si inseriranno nelle biglie contenenti adattatori A e B, seguiranno poi la PCR emulsio clonale e verranno sequenziate.

Target enrichment capture

Molto spesso le librerie di DNA vengono arricchite in modo tale da aumentarne le copie. Per fare ciò basta amplificare la libreria mediante una tecnica detta target enrichment capture ossia cattura del materiale arricchito. Infatti, spesso nel DNA antico non si costruisce direttamente la library e si sequenzia ma si fa un’operazione nota come “target enrichment”. Questo arricchimento selettivo utilizza delle sonde legate a biglie magnetiche che catturano molecole a loro complementari. In questo modo, una volta che il DNA della libreria si è ibridato alle sonde, con un magnete catturiamo il pool di sonde per poi analizzare le molecole di campione.

Questa tecnica ha vari vantaggi in quanto consente di avere un numero maggiore di target, permette di analizzare anche frammenti molto corti e mantiene inalterate le caratteristiche molecolari delle molecole estratte dai campioni.

Analisi e inferenze sui dati

Con la tecnologia NGS è possibile analizzare il genoma di individui vissuti nel passato anche senza conoscere la loro storia tafonomica. Inoltre, grazie a questa tecnologia, è possibile distinguere il DNA endogeno dal DNA esogeno in modo tale da valutare la bontà del campione ossia la quantità di DNA endogeno presente al suo interno. In questo modo, in base a questa quantità, sarà possibile decidere se scartare o meno il risultato. Innanzitutto sappiamo che il DNA antico è fortemente degradato e presenta miss incorporazioni particolarmente frequenti in posizione 5’ e 3’ con una prevalenza C verso T. La degradazione del DNA coinvolge tutta la molecola, tuttavia essendo l'estremità 5 primo tre primo scoperte a livello delle estremità vi è un numero di C verso T maggiore rispetto al resto della catena. La prevalenza di miss incorporazioni può essere associata al DNA di un individuo vissuto nel passato in quanto le sequenze mitocondriali dei Neanderthal possono essere distinte da quelle delle altre specie e analizzando queste sequenze si è visto che all’estremità 5’ e 3’ le missincorporazioni erano molto presenti, infatti generalmente il numero di miss incorporazione che posso trovare è 20/30, dunque su 100 molecole 20/30 avranno missincorporazioni e le altre no.

Per questo motivo le missincorporazioni possono essere considerate come dei marcatori dell’antichità del DNA recuperato. Inoltre, sapendo che la sequenza del DNA mitocondriale dei Neanderthal è differente da quella dei Sapiens, possiamo stabilire che dei frammenti analizzati appartengano a un individuo Neandertaliano oppure no. Per poter individuare con certezza le miss incorporazioni deve essere prodotto, mediante la PEC, un quantitativo molto alto di letture che mi consentono di ricostruire l’intera molecola di DNA mitocondriale. Abbiamo detto che il numero di missincorporazioni che posso trovare all'interno del DNA antico è di 20/30 (non tutte!), ciò significa che su 100 molecole solo 20,30 avranno miss incorporazioni alle estremità. Pertanto per distinguere del DNA antico che non ha miss incorporazioni da del DNA non antico che tuttavia manca anch’esso di miss incorporazioni posso basarmi sul motivo della sequenza che differisce dai Neanderthal alle altre specie homo. Quindi, se ho un DNA mit frammentato e altre molecole di DNA non frammentate ma con lo stesso motivo di sequenza ho a che fare con DNA endogeno. Infatti, il DNA antico privo di missincorporazioni viene confrontato con il motivo del DNA contenente missincorporazioni, se i motivi corrispondono fanno parte entrambi di un individuo vissuto nel passato.

Pertanto il DNA endogeno può essere distinto da quello esogeno sulla base delle CT in 5’ e 3’ e sulla base dei pattern di frammentazione che sono molto alti nei campioni antichi. Grazie a questo metodo dunque è possibile recuperare delle informazioni che possono poi essere utilizzate per fare delle inferenze sugli individui vissuti nel passato e ricostruire la loro storia evolutiva. Tuttavia, prima di fare ciò, bisogna essere sicuri di avere a che fare con un genoma antico. A tal proposito si può utilizzare un software noto come MAP DAMAGE che va a leggere le miss incorporazioni in 5’ e 3’ presenti in un pattern di reads generate sequenziando le librerie (generate dal DNA mit neandertaliano e quelle generate dal DNA contaminante). Infatti, solo grazie al sequenziatore NGS (Illumina) che fornisce un elevato numero di letture, un elevato numero di dati è possibile giungere a queste conclusioni.

Le miss incorporazioni tendono a diminuire passando da individui neanderthaliani 30-40% agli individui Sapiens dove arrivano a essere pari a 0. Nei Sapiens non vi sono miss incorporazioni e le estremità sono piatte pertanto conoscendo il motivo delle sequenze neandertaliane siamo sicuri che non sono Neanderthal e quindi sono necessariamente Sapiens.

Illumina

Con la metodologia NGS, le librerie possono essere lette anche con la tecnica Illumina. Il flusso di lavoro di Illumina prevede:

• Estrazione del DNA nella clean room.
• Costruzione librerie Illumina a partire dagli estratti nella post index room.
• Cattura e target enrichment.
• Analisi bioinformatica delle sequenze.

Processo di estrazione e sequenziamento

Inizialmente, a partire da un frammento osseo viene estratto il DNA. La molecola di DNA, essendo antica, risulta essere fortemente degradata con le estremità 5’ e 3’ non piatte. Pertanto, inizialmente grazie alla T4 polimerasi vengono riparate le estremità inserendo degli errori. Una volta ricostruite piatte, in 5’ e 3’ vengono inseriti, mediante una ligasi, due adattatori detti P5 e P7. Questi adattatori hanno una sequenza uguale nota ma una lunghezza diversa. Gli adattatori hanno un’estremità piatta e una impari. Questo meccanismo serve per far sì che gli adattatori si leghino alla molecola del campione nella direzione corretta.

Successivamente, mediante una polimerasi si estende il filamento di DNA laddove mancava e si ricostituiscono le estremità piatte. A questo punto, con una RT PCR con pochi cicli vengono inseriti i tag che in questo caso prendono il nome di indici, in questo modo dunque sarà possibile sequenziare insieme più campioni. Infine, avviene il sequenziamento. Con Illumina possono sequenziare un numero molto maggiore di molecole per corsa (non più 10⁵/10⁶ come nella 454). Questa differenza dipende dal fatto che non si impiegano più delle biglie ciascuna legante un frammento di DNA ma si ha un cluster di librerie ciascuna con il proprio indice.