Riassunto esame Metodologie biochimiche, Prof. Cappiello Mario, libro consigliato Biochimica, Lehninger

Spettrofotometria di assorbimento

Giovedì 17 febbraio 2022 alle 15:25

Assorbimento della radiazione elettromagnetica da parte della materia

Cosa è una radiazione elettromagnetica?

Una radiazione elettromagnetica è un'onda elettrica e magnetica: vettori di campo elettrico e campo magnetico che oscillano nel tempo e nello spazio. Ad un massimo dell'onda elettrica corrisponde un massimo dell'onda magnetica e a un minimo corrisponde un minimo; sono dunque in fase fra loro. Sono disposte su piani perpendicolari l'uno rispetto all'altro. Sono entrambe perpendicolari rispetto alla direzione di propagazione. La direzione di propagazione è perpendicolare rispetto ai vettori.

Lunghezza d'onda: lambda, è la distanza fra due massimi o fra due minimi.

Frequenza: ni, è il numero di volte che l'onda elettromagnetica si ripete nel tempo. Questi due parametri sono legati da questa relazione:

Frequenza * lunghezza d'onda = costante = velocità della luce nel vuoto.

Perciò, frequenza e lunghezza d'onda sono inversamente proporzionali! Maggiore è la frequenza, minore è la lunghezza d'onda e viceversa. L'onda elettromagnetica ha una certa energia ed è data dal prodotto della costante di Planck per frequenza; quindi, l'energia è direttamente proporzionale alla frequenza. Se aumenta la frequenza, l'energia aumenta. Più alta è la frequenza di un'onda, maggiore è l'energia. Dal punto di vista della lunghezza d'onda invece, maggiore è la lunghezza d'onda, minore è l'energia.

• Le onde radio hanno lunghezza d'onda maggiore e energia più bassa.
• Diminuendo la lunghezza d'onda, la frequenza aumenta e l'energia aumenta.
• I raggi gamma hanno la massima energia, massima frequenza e lunghezza d'onda minima.

Radiazioni del visibile e ultravioletto

Le radiazioni del visibile e nella regione dell'ultravioletto sono usate per spettrofotometria.

Quali sono le lunghezze d'onda che compongono lo spettro del visibile?

Le lunghezze d'onda che vanno da 400 nm a 800 nm. Sono visibili perché abbiamo sviluppato delle strutture recettoriali in grado di captare queste radiazioni elettromagnetiche... come un'antenna è in grado di captare altri tipi di radiazione elettromagnetiche a altre lunghezze d'onda. Sopra i 700 nm siamo nell'infrarosso, mentre sotto i 400 nm siamo nell'ultravioletto.

Come appaiono queste radiazioni elettromagnetiche?

La luce bianca contiene tutte queste onde in tutte le lunghezze. Per scomporla vedremmo: a 700 nm corrisponde rosso, a 650 nm corrisponde arancio, a 600 nm il giallo, a 550 nm il verde, a 500 nm il blu, ecc. Queste lunghezze d'onda appaiono a noi come luce colorata.

Interazione della radiazione elettromagnetica con la materia

Come fa la radiazione elettromagnetica a interagire con la materia e le molecole che la costituiscono?

Un fenomeno che ci fa capire che la radiazione interagisce con la materia è il fatto che noi percepiamo i colori: i vari oggetti si presentano con colori differenti. Ci appaiono colorati gli oggetti; per esempio, un oggetto è verde perché viene assorbito il colore complementare, quello che combinato col verde dà il bianco. Basta guardare la scala delle lunghezze d'onda. Il verde lo accoppio con il rosso, l'arancio con il blu, il giallo con il violetto. Un oggetto è verde perché assorbe il rosso. La clorofilla ha un picco di assorbimento nel rosso, quindi appare verde. Il paranitrofenil fosfato è giallo perché assorbe nel violetto e appare giallo. Il fatto che un oggetto appaia colorato indica che la materia interagisce con la radiazione, ne assorbe una parte e non può assorbire un intervallo molto ampio. È più probabile che si assorba una sola lunghezza d'onda o tante? Una piuttosto che tutte.

Interazione con le molecole

Nella figura (non inclusa qui) sono rappresentati i livelli energetici di una molecola biatomica. Sono i livelli energetici che possono essere assunti dagli elettroni di valenza. La molecola tenderà a livelli energetici più bassi nello stato fondamentale. Qui ci sono due livelli energetici, uno fondamentale e uno più alto. Oltre ai livelli energetici degli elettroni di valenza, abbiamo altri livelli energetici: una molecola può vibrare e ruotare. Ciascun livello energetico è a sua volta suddiviso in più livelli vibrazionali e ciascun livello vibrazionale è suddiviso in rotazionale. Una molecola può assumere diversi livelli energetici; tutti questi sono quantizzati. Può assumere valori discreti di energia.

Questa molecola biatomica si può trovare o nello stato fondamentale o nello stato eccitato; non può andare ad assumere livelli intermedi. Ossia, assorbe solo radiazioni in grado di far passare da stato fondamentale a stato eccitato. Quando questa molecola verrà colpita da radiazione che ha energia uguale a questo salto, allora assorbirà e passerà da stato fondamentale a stato eccitato.

Come sono messi i livelli? Ci vuole la stessa energia per far passare da livello elettronico o rotazionale?

No. La radiazione infrarossa è in grado di determinare variazioni nello stato rotovibrazionale della molecola, ossia determina salti vibrazionali e rotazionali per salti energetici piccoli. Per determinare il salto di elettroni di valenza è necessaria più energia, sempre quantizzata; per determinare salti nello stato elettronico occorrono lunghezze d'onda minore e quindi frequenze maggiori.

Ci sono strutture in una molecola che rendono l'assorbimento più facile e strutture che rendono la molecola meno eccitabile. La molecola assorbe a seconda della sua struttura; in certi casi la struttura facilita l'assorbimento e altre volte la sua struttura richiede energie più alte. Arriva radiazione elettromagnetica, se h*ni = differenza fra stato fondamentale e eccitato, allora la molecola assorbe e passa da stato fondamentale a eccitato. Si ha assorbimento di radiazione elettromagnetica solo se l'energia è sufficiente.

Dopo l'assorbimento della radiazione elettromagnetica

Cosa succede una volta che la radiazione elettromagnetica è stata assorbita da una molecola?

Si ha un passaggio da stato fondamentale a eccitato, ma poi? La molecola tenderà a tornare allo stato a bassa energia. E quell'energia che ha accumulato che fine fa? Una prima possibilità è che l'energia assorbita sia dissipata in calore: la molecola torna a stato fondamentale e dissipa l'energia accumulata (assorbimento semplice). Una seconda possibilità è il fenomeno della fluorescenza. Sostanze fluorescenti sono molecole che assorbono radiazione ma nel tornare allo stato fondamentale emettono a loro volta una radiazione elettromagnetica. La cosa interessante è che la radiazione emessa ha una lunghezza d'onda maggiore e quindi energia minore. Emette un'energia più bassa perché nell'intervallo richiesto perché la molecola torni allo stato fondamentale, una parte viene dissipata sotto forma di calore. La sostanza fluorescente assorbe a una certa lunghezza d'onda e riemette a lunghezze d'onda maggiori perché parte dell'energia viene dissipata. Questo è alla base delle tecniche spettrofluorimetriche.

Fosforescenza (es. un orologio che si illumina al buio): la radiazione viene assorbita e dopo l'emissione continua per un tempo molto lungo. Perché? Si ha un passaggio a stato eccitato e si ha inversione di spin degli elettroni. Quindi può tornare a stato fondamentale? L'orbitale può essere occupato da due elettroni con spin opposti; se l'elettrone ha cambiato spin, può tornare? Prima deve invertire lo spin, se no non può tornarci. Siccome l'inversione di spin non è un fenomeno frequente, allora richiede tempi lunghi per poter tornare l'elettrone. Finché rimane allo stato eccitato non può riemettere. Ecco che la fosforescenza ha tempi lunghi perché l'elettrone deve cambiare spin.

Interazione con molecole in soluzione

Cosa succede alla radiazione elettromagnetica che va a interagire con molecole in soluzione?

C'è un recipiente, la cuvetta, e si riempie con una soluzione contenente una certa molecola. Si fa interagire questa soluzione con radiazione elettromagnetica che sia in grado di essere assorbita da molecole in soluzione.

Se misuriamo l'intensità della radiazione prima di entrare nella cuvetta e quando esce, cosa succede?

L'intensità sarà calata.

Immaginiamo di usare un recipiente più grande, di mettere la stessa soluzione con la stessa concentrazione e far passare la stessa radiazione. Che succederà? L'intensità uscente sarà diminuita perché il cammino ottico è aumentato; quindi la radiazione elettromagnetica entrante è stata assorbita di più. Se invece si aumenta la concentrazione, l'intensità in uscita sarà più bassa.

L'intensità in uscita dalla cuvetta = I(0) * 10 ^- (ε * c * d)

Log (I0/I) = A = ε * c * d = Assorbanza (logaritmo del rapporto fra intensità di luce entrante e uscente)

ε = coefficiente di estinzione dipende dalla natura delle molecole che assorbono, ci sono configurazioni elettroniche che favoriscono assorbimento e configurazioni che fanno l'opposto. Alcune strutture sono eccitabili.

Tra assorbanza e concentrazione che rapporto c'è?

Sono direttamente proporzionali, quindi se la concentrazione raddoppia, raddoppia l'assorbanza. L'assorbanza è direttamente proporzionale al cammino ottico. L'assorbanza è adimensionale! Epsilon, perciò, ha dimensione M^-1 * cm^-1.

Cenni storici

La trasmittanza era misurata nell'antichità. Rapporto di I/I0 Trasmittanza 80% = assorbanza 20%

Perché usiamo l'assorbanza?

Perché ha andamento lineare, mentre la trasmittanza è una curva. La trasmittanza, se uso una scala logaritmica, diventa lineare. Invece l'assorbanza ha dipendenza lineare.

A = εCd

Cosa è l'assorbanza?

A = log (I0/I)

• Se A=1, il logaritmo vale 1, quindi log (I0/I) = 1, quindi 10^? = 1, quindi I0/I deve valere 10 (il rapporto deve valere 10¹). 10¹ fa 10. Se entra 100, esce 10.
• Se leggo A = 1, vuol dire che il 90% delle radiazioni è stata assorbita e ne è passata solo il 10%.
• Se invece A = 2, vuole dire log I0/I = 2 quindi 10² = 100 (il rapporto deve valere 10²).

Quindi I0/ e quindi 100/1 =100. Ne ha assorbito il 99%.

È sempre valida questa legge?

Non è sempre applicabile... è valida solo se le molecole che assorbono in soluzione si comportano da agenti di assorbimento indipendenti, ossia non risentono della presenza delle altre molecole. Per essere valida, le molecole assorbono indipendentemente le une dalle altre, ossia quando sono distanziate fra di loro quando la concentrazione è bassa, solo per soluzioni diluite. Se la legge di Lambert Beer è valida, allora vale il principio di additività... finora abbiamo considerato che in soluzione ci fosse una sola molecola, però questo è un caso limite, mentre invece spesso in soluzione ci sono più molecole in grado di assorbire a una determinata lunghezza d'onda e quindi di contribuire all'assorbanza complessiva. L'assorbanza complessiva sarà la somma.

Lo spettrofotometro

• 1) Spettrofotometro è composto da una lampada che produce radiazione elettromagnetica, (o una sola con radiazione nel visibile e si chiama colorimetro oppure solitamente spettrofotometro ha due lampade e una emette nella regione del visibile e l'altra nell'UV). Una lampada a tungsteno che emette tra 350 e 1000 nm e una lampada a deuterio da 190 a 400 nm nell'ultravioletto. Nelle lampade a tungsteno c'è un filamento di tungsteno in cui passa corrente, il filamento si surriscalda e emette radiazione nel visibile e quindi luce bianca. Mentre nella lampada a deuterio una scarica elettrica determina l'eccitazione delle molecole che emettono radiazione elettromagnetica nell'ultravioletto.
• 2) Monocromatore è il secondo dispositivo che tra tutte le lunghezze d'onda presenti nell'intervallo di frequenza seleziona quella che interessa. Ci sono due tipi di monocromatori: Un prisma è il monocromatore più semplice che divide l'intervallo di lunghezze d'onda della luce bianca. Più sofisticati sono i monocromatori a diffrazione che sfruttano la diffrazione per selezionare varie lunghezze d'onda fra tutte quelle emesse. Il fascio di luce in uscita è monocromatico, quindi a un'unica lunghezza d'onda, viene fatto passare nella cuvetta.
• 3) Cuvette possono essere di plastica, vetro e quarzo. La scelta dipende dalla misurazione che vogliamo fare. Se facciamo misure nel visibile, da 350 a 700 nm, usiamo vetro, plastica o quarzo tutte indifferentemente. Se invece facciamo misura nell'ultravioletto, dobbiamo usare il quarzo perché le cuvette di plastica e vetro non lasciano passare l'ultravioletto.
• 4) Fototubo è un apparato che per effetto fotoelettrico converte fotoni in elettroni e si ha la generazione di corrente elettrica che viene misurata dallo strumento. I fotoni vengono convertiti in segnale elettrico e lo strumento misura l'intensità del raggio luminoso e fa il confronto fra un bianco in cui non c'è molecola che assorbe e la soluzione in cui c'è molecola che assorbe e calcola il logaritmo di questo rapporto, ossia assorbanza. Un chopper manda luce alternativamente su campione e sul bianco; contemporaneamente abbiamo due raggi che attraversano campione e riferimento. Il raggio di riferimento ci darà I0, ossia senza molecola che assorbe. Il raggio che attraversa campione mi darà intensità dopo che la molecola ha assorbito. I0 = raggio di riferimento, I = raggio del campione. Il loro rapporto darà assorbanza!

Misure di assorbanza

Le misure che facciamo di assorbanza sono sempre utili per i nostri scopi? Qualunque misura può essere usata per determinare concentrazione?

Non tutte, perché per ogni strumento dobbiamo definire il campo dinamico strumentale. Questo è valido per tutti gli strumenti di misura.

Cosa è il campo dinamico strumentale?

Quell'intervallo di misure per cui siamo sicuri che la nostra misura di assorbanza non sia affetta da un errore superiore a 1%. Ha a che fare con i limiti dello strumento. Il campo dinamico per lo spettrofotometro è l'intervallo di assorbanza per cui sappiamo che la nostra misura non è affetta da un errore superiore all'1%.

Come si determina il campo dinamico strumentale?

L'errore è quanto la nostra misura si discosta dal valore reale.

Errore = | Assorbanza misurata - Assorbanza teorica | / Assorbanza teorica. Quindi costruiamo un grafico in cui riportiamo errore in funzione dell'assorbanza misurata. Prendiamo una soluzione di cui conosciamo la concentrazione, misuriamo l'assorbanza e se conosciamo la concentrazione per la legge di Lambert Beer conosciamo anche l'assorbanza teorica. Se facciamo questo con una soluzione a concentrazione nota, i nostri punti fanno una specie di parabola. Il campo dinamico strumentale è l'intervallo di assorbanza in cui non si presenta errore superiore a 1%. Il campo è dato dall'intersezione di una retta orizzontale con il grafico. Se trovo un valore di assorbanza che rientra in questo intervallo, sono sicuro che la mia misurazione è affetta da errore inferiore a 1%. Se invece trovo un valore che rientra nella zona a destra o sinistra, la mia misura non è una misura utile; non è colpa mia ma per ragioni legate allo strumento la mia misura è affetta da un errore superiore a 1%.

Perché lo strumento mi dà errori in certi intervalli di assorbanza?

Mi dà errore quando l'assorbanza è piccola o quando l'assorbanza è grande. I fenomeni che stanno alla base dell'errore in queste zone a bassa e alti valori di assorbanza sono differenti. L'errore a basse assorbanze è dovuto al fatto che la misurazione è affetta da rumore di fondo nello strumento. La lampada deve emettere sempre la stessa intensità di luce nel tempo ma una lampada reale ha comunque piccole fluttuazioni nell'emissione, piccole fluttuazioni. Questo genera una incertezza a valori bassi di assorbanza. Quando è che ho assorbanza 0? Quando il rapporto vale 1. Il mio strumento misura stessa intensità I0 e I. Log 1000/1001 = -0,0004. Non è proprio zero quindi; c'è incertezza nel valore e quindi l'incertezza è sentita quanto più vicini siamo allo zero. Il rumore di fondo mi rende poco affidabili le misure a bassi valori di assorbanza. Non fissiamoci su 4 cifra decimale perché quella oscilla; basta fermarsi alla terza cifra. Nel modello dello spettrofotometro io presento in pratica due cuvette di riferimento.

Invece ad assorbanze alte assume importanza la luce diffusa o stray light, fotoni che arrivano al nostro strumento di misura senza seguire il cammino ottico che dovrebbero seguire. Supponiamo che ci sia un forellino sul nostro strumento di misura. Sul fototubo che fotoni arrivano? Arriveranno i fotoni del cammino ottico e i fotoni che passeranno attraverso quel forellino. Il fototubo converte tutti i fotoni e non distingue se questi provengono dal cammino ottico o no. La luce diffusa è minima rispetto a quella del cammino ottico, ma ad alti valori di assorbanza è importante. Immaginiamo di avere assorbanza = 1 I0 = 1000 per esempio, quindi I = 100. Se un fotone arriva allo strumento senza seguire il giusto percorso, si misura 1000/101. Quindi una soluzione che dovrebbe leggere 1 quanto misurerà in realtà? Log 1000/101 = 0.995. (0,995-1)/1 = 0,5% e va ancora bene come valore. Proviamo a salire. Se A = 2, Log (1000/101) = 1.958. Errore (2-1,958)/2 = 2,1%. E qui errore > 1%. La luce diffusa è rimasta la stessa ma aumentando l'assorbanza è aumentato l'errore.

Se A = 3, Log (1000/1+1 che è luce diffusa) = 2,699. Errore (3-2,699)/3 = 10%. Man mano che aumenta l'assorbanza che misuro, l'errore diventa sempre più grande. Leggere un valore 3 non ha senso! E se per caso avessi una soluzione che assorbe tantissimo e leggo 2,5 ma so che non va bene, che faccio? Diluisco il mio campione e cerco di riportarmi a un valore di assorbanza che rientri nel campo dinamico del mio strumento.

Applicazioni della spettrofotometria

La prima cosa che posso fare è studiare come una molecola assorbe.