Riassunto esame Biochimica, Prof. Cappiello Mario, libro consigliato I principi di Biochimica, Lehninger

Respirazione cellulare

La respirazione avviene in presenza di O₂ nei mitocondri a partire dal piruvato, ed avviene in 3 fasi:

1. Decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA
2. Ciclo di Krebs
3. Fosforilazione ossidativa

Decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA

La reazione che porta alla formazione di acetil-CoA è una decarbossilazione ossidativa, irreversibile, catalizzata dal complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi (E1 + E2 + E3), il cui agente ossidante è il NAD⁺. Tale reazione avviene nel mitocondrio, dove il piruvato viene traslocato mediante un trasportatore specifico.

Acetil-CoA

L'acetil-CoA presenta un legame tioestere (ad alta energia) che si forma tra:

• Il gruppo acetile (-COCH₃) derivante dal piruvato
• Il gruppo tiolico (-SH) della molecola Coenzima-A, che nella sua struttura presenta:
  • Un derivato purinico, la 3'-fosfoadenosina difosfato,
  • Una molecola di acido pantotenico, che è una vitamina e come tale deve essere ottenuta con la dieta,
  • Una β-mercapto-etilammina, che contiene la porzione reattiva di tutto il CoA, cioè il gruppo tiolico (-SH); infatti il CoA viene indicato spesso come CoA-SH.

Complesso piruvato deidrogenasi

I complessi multienzimatici sono complessi di diversi enzimi che catalizzano tappe successive di una via metabolica e sono uniti tra di loro tramite legami deboli, formando appunto un complesso. Il complesso della piruvato deidrogenasi è formato da tre enzimi diversi, ciascuno dei quali presente in più copie a seconda delle specie (in E. coli sono presenti 24 subunità di E1 e di E2, e solo 12 di E3, mentre nei mammiferi il numero di subunità è diverso ma il meccanismo d'azione è lo stesso):

• Piruvato decarbossilasi (E1): è una liasi e catalizza la decarbossilazione ossidativa del piruvato.
  • Ha come coenzima (partecipa al meccanismo di reazione in maniera non stechiometrica bensì catalitica, cioè viene rigenerato) la tiamina pirofosfato (TPP), che è un derivato della vitamina B1, la tiamina, che deve essere ingerita con la dieta (una carenza di tiamina determina l'insorgenza di una malattia di carattere neurologico detta beriberi, in passato molto diffusa nella popolazione cinese, soprattutto nelle campagne, dove la dieta è a base quasi esclusiva di riso privato della porzione esterna, nella quale si trova la tiamina).
• Diidrolipoil-transacetilasi (E2): è una transferasi e catalizza il trasferimento del gruppo idrossietile al CoA.
  • Ha come coenzima il lipoammide (lipoillisina), che è un derivato dell'acido lipoico, con 8 C e un gruppo carbossilico, ed è un acido grasso anomalo perché possiede due gruppi SH e si può presentare in forma ossidata (disolfuro, in una struttura ad anello) o in forma ridotta (ditiolo, e questa forma è chiamata diidro-lipoammide). È legata ad un residuo di lisina dell'enzima E2 tramite legame ammidico.
  • Ha come cofattore (= coenzima stechiometrico, cioè è presente nella stechiometria della reazione) il CoA.
• Diidrolipoil-deidrogenasi (E3): è una ossidoreduttasi e catalizza la rigenerazione della forma ossidata del lipoammide.
  • Ha come coenzima il FAD.
  • Ha come cofattore (= coenzima stechiometrico, cioè è presente nella stechiometria della reazione) il NAD.

Un complesso multienzimatico, rispetto a enzimi non vicini fisicamente, aumenta l'efficienza catalitica perché:

• Vengono evitati i processi legati alla diffusione del substrato: nel caso di due enzimi in un complesso, il primo catalizza la prima reazione e il prodotto si viene a localizzare direttamente sul sito attivo del secondo enzima.
• L'intermedio viene incanalato verso la reazione successiva e si limitano reazioni collaterali a cui potrebbe andare incontro.

Meccanismo d’azione del complesso piruvato deidrogenasi

Piruvato decarbossilasi (E1):

1. Decarbossilazione del piruvato che resta sotto forma di idrossietile legato alla tiamina pirofosfato:

Questa prima tappa è la più lenta, ed è anche il punto in cui il complesso PDH esercita la specificità di substrato.

1. Il protone del C2 viene sottratto da un residuo basico dell'enzima E1; ciò è possibile perché la tiamina pirofosfato ha la porzione reattiva nell'anello tiazolico, che possiede un atomo di azoto carico positivamente che rende l'atomo di C2 dell'anello molto acido, perciò esso tende a perdere facilmente il protone convertendosi in una forma anionica, in grado di trasportare gruppi idrossietile.
2. La tiamina pirofosfato in forma anionica (carbanione) fa un attacco nucleofilo sul gruppo carbonilico del piruvato, formando un intermedio tetraedrico;
3. La carica positiva sull'anello tiazolico fa da attrattore di elettroni, perciò c'è uno spostamento di elettroni verso di essa che permette il rilascio di anidride carbonica (= decarbossilazione) e si forma idrossietil-tiamina-pirofosfato, una struttura stabilizzata per risonanza. Quindi l’atomo C1 del piruvato viene lasciato sotto forma di CO₂ e l’atomo C2 del piruvato (dove lì ha lo stato di ossidazione di un’aldeide) rimane legato alla TPP come gruppo idrossietilico. (E1, reazione 1)

2. Trasferimento del gruppo idrossietile dalla tiamina pirofosfato alla lipoammide:

1. L'idrossietile legato alla tiamina attacca il ponte disolfuro del lipoammide (il coenzima di E2), riducendolo, e si ha la formazione di un intermedio;
2. Si ha sottrazione di un protone da parte di un residuo basico dell'enzima che comporta trasferimento di elettroni verso la tiamina pirofosfato, che viene quindi liberata, mentre l'unità bicarboniosa resta legata alla lipoammide sotto forma di acetile (il gruppo idrossietile si è ossidato convertendosi in acetile). (E1, reazione 2)

Diidrolipoil transacetilasi (E2):

3. Trasferimento del gruppo acetile dalla diidrolipoammide al coenzima-A per formare acetil-CoA:

Si ha un processo di transesterificazione, ovvero il gruppo acetile viene trasferito sul CoA, quindi il legame tioestere tra acetile e diidrolipoammide diventa legame tioestere tra acetile e CoA.

Si forma quindi acetil-CoA e l'acido lipoico resta in forma ridotta, come diidrolipoammide. (E2, reazione 3)

Diidrolipoil deidrogenasi (E3):

4. Rigenerazione della forma ossidata del lipoammide ad opera del FAD:

Dalla tappa 3 si erano formati acetil-CoA e l'acido lipoico in forma ridotta, come diidrolipoammide, ma se questo restasse così, l'enzima non potrebbe più funzionare, perciò è necessario che la diidrolipoammide venga ossidata: la E3 catalizza il trasferimento di due atomi di H dal gruppo lipoilico ridotto al FAD che si riduce a FADH₂; così il lipoammide si ossida.

5. Ossidazione del FADH₂ a FAD:

Affinché il ciclo catalitico possa rinnovarsi, il FADH₂ deve essere riossidato a FAD, e per fare ciò, sempre sull’E3, il FADH₂ trasferisce uno ione idruro al NAD⁺, formando NADH.

Regolazione del complesso piruvato deidrogenasi

La regolazione del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi influisce sul ciclo di Krebs, perché fornisce le unità di acetile che servono per portare avanti l'intera via metabolica.

Questo complesso è soggetto a due tipi di regolazione:

• Regolazione di tipo allosterico: ciò che influenza l'attività dell'enzima non sono tanto i livelli assoluti dei metaboliti attivatori e inibitori ma i loro rapporti:
  • Acetil-CoA/CoA: se tale rapporto è alto (alta carica energetica) si ha inibizione di E2, se è basso se ne ha l’attivazione.
    • Inibitore di E2: acetil-CoA
    • Attivatore di E2: CoA
  • NADH/NAD⁺: se tale rapporto è alto (alta carica energetica) si ha inibizione di E3, se è basso si ha attivazione.
    • Inibitore di E3: NADH
    • Attivatore di E3: NAD⁺
  • ATP/AMP: se tale rapporto è alto (alta carica energetica) si ha inibizione di E3, se è basso si ha attivazione.
    • Inibitore di E3: ATP
    • Attivatore di E3: AMP; una attivazione da parte di AMP trova la logica nel fatto che uno dei compiti del ciclo di Krebs è produrre NADH, che, trasferendo i suoi elettroni all'ossigeno, determina poi la formazione di un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale interna che viene sfruttato per produrre ATP. Il ciclo porta quindi indirettamente alla formazione di ATP, perciò quando aumentano i livelli di AMP il ciclo di Krebs deve essere attivato.
• Regolazione mediante modificazione covalente: che si realizza sulla componente E1 del complesso, a livello di un residuo di serina, ed è catalizzata da una chinasi specifica per la piruvato deidrogenasi.

Il complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi, oltre a E1, E2 ed E3, contiene due proteine regolatrici la cui sola funzione è quella di modulare l’attività del complesso andando a fosforilare e defosforilare un residuo di serina situato in E1; questi enzimi sono:

• Piruvato deidrogenasi chinasi: fosforila la serina di E1 determinandone l’inattivazione. Anche la chinasi è soggetta ad un processo di modulazione:
  • Inibitori: piruvato (quindi in presenza di alte cc di piruvato, la piruvato deidrogenasi è attiva)
  • Attivatori: NADH, acetil-CoA e ATP (che inibiscono la piruvato deidrogenasi anche direttamente)
• Piruvato deidrogenasi fosfatasi: defosforila il residuo di serina di E1, riportandolo alla forma attiva defosforilata. Anche la fosfatasi è soggetta ad un processo di modulazione:
  • Inibita dal NADH
  • Attivata dal Ca²⁺: i livelli intracellulari di calcio aumentano in risposta allo stimolo ad una maggiore produzione di ATP; [il caso tipico è quello della contrazione muscolare: perché avvenga la contrazione, è necessario un aumento della concentrazione del Ca²⁺, che attiva la fosfatasi, che defosforila la piruvato deidrogenasi attivandola, quindi aumenta la produzione di acetil-CoA che entra nel ciclo di Krebs, determinando un aumento nella produzione di ATP che serve al muscolo per potersi contrarre (l’ATP è necessario per l’attacco della testa della miosina sull’actina). Il Ca²⁺ va a legarsi alla troponina che determina un cambiamento conformazionale della tropomiosina, che scopre i siti di legame della miosina (consuma ATP) sull’actina].

Ciclo di Krebs (o dell’acido citrico)

Il ciclo di Krebs è una via metabolica ciclica composta da 8 reazioni (di cui tre irreversibili: 1, 3 e 4) effettuata da organismi aerobici per generare energia attraverso l’ossidazione di acetil-CoA (proveniente dal catabolismo di carboidrati, grassi e proteine) a CO₂. L’energia viene prodotta tramite la fosforilazione di GDP (ADP) e la produzione dei fattori riducenti NADH e FADH₂.

Condensazione di Claisen: irreversibile

La prima reazione è catalizzata dalla citrato sintasi e consiste nella condensazione tra acetil-CoA (= tioestere) e ossalacetato (= chetone; acido bicarbossilico a 4C) a formare il citrato (= acido tricarbossilico a 6C).

Questa condensazione di Claisen converte il gruppo metilico (-CH₃) dell’acetil-CoA in gruppo metilenico (-CH₂-) nel citrato poiché l’atomo del C metilico del gruppo acetilico si lega al C2 del gruppo carbonilico dell’ossalacetato.

Citrato sintasi:

Ciascuna subunità dell’enzima omodimerico (= 2 subunità identiche legate tra loro) è costituita da un singolo polipeptide con 2 domini:

• Uno grande e rigido
• Uno piccolo e flessibile

e il sito attivo si trova tra i due domini (quindi una citrato sintasi ha 2 siti attivi identici).

Sul sito attivo dell’enzima si forma come primo prodotto l’intermedio tioestere citril-CoA che va incontro a una tappa di idrolisi, producendo CoA e citrato, poi rilasciati dal sito attivo. Il CoA liberato viene riciclato e può partecipare alla decarbossilazione ossidativa di un’altra molecola di piruvato.

La formazione dell’intermedio tioestere citril-CoA risolve il problema della scarsa reattività del gruppo metilico dell’acetil-CoA: il carbonile dell’ossalacetato agisce da centro elettrofilo che viene poi attaccato dal C metilico dell’acetil-CoA in una condensazione di Claisen.

L’idrolisi del citril-CoA a elevata energia rende la reazione di scissione fortemente esoergonica; il ΔG’° molto negativo (-35,3 KJ/mol) è essenziale per il funzionamento del ciclo, perché la concentrazione di ossalacetato è molto bassa.

Meccanismo:

0. L’enzima citrato sintasi ha un meccanismo d’azione ordinato a due substrati: il primo substrato a legarsi è l’ossalacetato, e quando esso si lega, il dominio flessibile di ciascuna subunità va incontro ad una marcata variazione conformazionale, creando un sito di legame per l’Acetil-CoA (esempio di adattamento indotto).
1. Formazione dell’intermedio enolato
2. Formazione dell’intermedio tioestere citril-CoA (citroil-CoA)
3. Idrolisi citril-CoA

Deidratazione (2a) e reidratazione (2b) (isomerizzazione del citrato a isocitrato)

L’enzima aconitasi (o aconitato idratasi, che è una liasi) catalizza l’isomerizzazione reversibile del citrato in isocitrato.

Aconitasi:

È una proteina moonlighting (= cioè una proteina che svolge più funzioni nella cellula): contiene un centro Fe-S che gli conferisce due ruoli:

• L’aconitasi è un enzima: il centro Fe-S agisce sia nel legame del substrato con il sito attivo, che nell’aggiunta o rimozione catalitica dell’acqua;
• L’aconitasi è un regolatore della sintesi proteica: nelle cellule in cui la cc di ferro è bassa, l’aconitasi perde il suo centro Fe-S e acquisisce un ruolo nella regolazione dell’omeostasi del ferro (pag 658).

Meccanismo: avviene in 2 processi:

2a Deidratazione: viene eliminata acqua, con formazione di un legame doppio nell'intermedio cis-aconitato (= acido tricarbossilico) che non viene rilasciato dall'enzima.

2b Idratazione: si ha l'introduzione di una molecola d'acqua con formazione di isocitrato. Tale aggiunta di una molecola d’acqua al doppio legame del cis-aconitato può avvenire in due modi diversi:

• Uno porta al citrato (cioè si torna indietro)
• L’altro porta all’isocitrato (la reazione va avanti);

anche se la reazione all’equilibrio contiene meno del 10% di isocitrato, nella cellula la reazione viene spinta verso destra dal consumo molto rapido di isocitrato da parte della tappa 3 che abbassa la sua concentrazione allo stato stazionario.

Decarbossilazione ossidativa (ossidazione dell’isocitrato ad α-chetoglutarato): irreversibile

Tale reazione è catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi (= ossidoreduttasi, metallo enzima), è irreversibile e rappresenta un punto di controllo della funzionalità di questa via metabolica.

Isocitrato deidrogenasi:

Vi sono due isoforme dell’enzima, che reagiscono nello stesso modo:

• Isoenzima NAD-dipendente: richiede NAD⁺ come accettore di elettroni presenti nella matrice mitocondriale, e opera all’interno del ciclo di Krebs.
• Isoenzima NADP-dipendente: richiede NADP⁺ come accettore di elettroni presenti nella matrice mitocondriale e nel citosol, ed è utilizzato per generare NADPH (è essenziale per le reazioni anaboliche riduttive).

Meccanismo:

1. Ossidazione dell'isocitrato, con trasferimento di uno ione idruro sul NAD⁺. Si formano così NADH, H⁺ e l'intermedio ossal-succinato.
2. Decarbossilazione dell’ossal-succinato, con liberazione di CO₂ e formazione di un enolo di transizione che viene stabilizzato dalla presenza di Mn²⁺, il quale si lega alle sue due cariche negative: la isocitrato deidrogenasi, per poter funzionare, richiede infatti manganese ed è quindi un metallo-enzima.
3. Protonazione dell’intermedio enolico, che porta alla forma chetonica, con formazione di α-chetogluta