Riassunto esame Citologia e istologia: laboratorio, Prof. Sabata Martino, libro consigliato Biologia molecolare , B. Alberts

Biologia generale, primo semestre 2021

Lezione 1

Una molecola per agire si associa ad altre molecole: insieme generano un processo biologico. La cellula è l’unità strutturale e funzionale della materia vivente. La materia vivente, infatti, è costituita da mattoncini di forma diversa che insieme formano degli organismi.

Esistono gli organismi unicellulari costituiti da un’unica cellula che svolge la funzione di un organismo intero, e gli organismi complessi o pluricellulari costituiti da più cellule che si associano per garantire lo svolgimento di funzioni biologiche. Un esempio di organismi unicellulari sono i batteri, mentre tra gli organismi pluricellulari troviamo l’uomo (>10¹⁴ cellule).

Le cellule sono in grado di dividersi e dare luogo ad unità identiche a loro stesse. Hanno origine solo dalla divisione di cellule preesistenti (divisione binaria).

Caratteristiche fondamentali della materia vivente e loro implicazioni

Capacità di accrescere la propria massa: la materia vivente è capace di trasformare composti inorganici in composti organici e quindi di trasformare al proprio interno materia ed energia. A garantire queste proprietà di base ci sono dei meccanismi che fanno in modo che la cellula produca energia e si accresca.

Capacità di autoriprodursi dando origine ad individui con le stesse caratteristiche dei genitori: all'interno delle cellule sono presenti gli acidi nucleici che hanno garantito la perpetuità ripetitiva delle caratteristiche biologiche. Esiste un meccanismo di replicazione e di trasmissione dell’informazione genetica specifica di ciascun organismo; esiste un meccanismo di replicazione del DNA che assicura la conservazione dell’informazione; esistono meccanismi che assicurano la precisa ripartizione del materiale replicato tra le cellule-figlie (mitosi e meiosi); esistono meccanismi che controllano la divisione cellulare in funzione della crescita della cellula e della replicazione del materiale genetico. La moltiplicazione delle cellule degli organismi avviene solo quando il materiale genetico è stato duplicato e la crescita è stata sufficiente.

Le cellule viventi hanno tutte una chimica di base simile anche se possiedono funzioni e forme diverse e sono composte da pochi tipi di atomi. La cellula è formata da composti del carbonio.

Proprietà essenziali di una cellula

• Membrana plasmatica: separa la cellula dall’ambiente ed è deputata a trasportare sostanze nutritive.
• Genoma: codifica le strutture cellulari.
• DNA: nelle cellule eucarioti si trova all’interno della membrana nucleare mentre nei procarioti è libero.
• Trasferimento dell’informazione: esprime l’informazione immagazzinata nel codice genetico.
• Utilizzazione dell’energia: raccoglie l’energia per formare componenti più complessi.

Tutte le cellule sono delimitate da una membrana cellulare che le protegge e ne controlla l’omeostasi. Le cellule sono classificate in base al numero di compartimenti in cui sono suddivise. Un compartimento è definito come un volume delimitato da membrana.

Involucro cellulare

1. Citosol
2. Membrana esterna
3. Involucro (spazio intermembrana)
4. Membrana interna
5. Organello

Teoria cellulare

Si pensa che la vita sia iniziata quando qualche tipo di struttura autoreplicante si separò dal suo ambiente naturale: l’RNA (era capace di replicarsi). Un evento fondamentale della teoria è che si pensava che l’RNA fosse coinvolto nella formazione della membrana.

Differenza tra procarioti ed eucarioti

Le cellule eucariotiche

Cellula animale

Il pH e la concentrazione di Ca²⁺ dei compartimenti cellulari sono diversi. Le attività biologiche non sono altro che delle reazioni chimiche. Affinché queste avvengano è necessario che ci siano delle reazioni stechiometriche ed il pH è un parametro fondamentale che ci dice che le molecole possono vivere a determinati valori (es: nei lisosomi il pH è 4.5 per cui le reazioni possono avvenire solo in ambiente acido).

Cellula vegetale

A differenza della cellula animale possiede i tilacoidi deputati alla fotosintesi clorofilliana.

Le cellule procariotiche

Il materiale genetico non è protetto dalla membrana (il nucleo non esiste) ma è aiutato da componenti della membrana plasmatica che creano dei microambienti per fare in modo che il DNA possa posizionarsi ed agganciarsi. Si sono adattati alla crescita in numerose condizioni diverse anche perché, oltre alla membrana plasmatica hanno anche una parete che li protegge. Sono un esempio i mesofili (batteri patogeni per l’uomo), gli psicrofili, i termofili, gli acidofili ed i basofili.

I virus

Un virus è un complesso macromolecolare formato da un genoma virale racchiuso in un involucro proteico detto capside.

Differenze tra virus e organismi viventi

• Mancanza del sistema generatore di ATP
• Mancanza di attività metabolica
• Mancanza di membrane interne e ribosomi
• Un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA)

La terapia genica

Tecnologia innovativa che utilizza le tecniche del DNA ricombinante per poter curare le malattie genetiche. Il modo più semplice per veicolare ai pazienti il gene sano è quello di utilizzare un virus modificato ed incapace di replicarsi che diventa solo un veicolo che trasporta la molecola terapeutica ovvero il DNA. Siccome quando si fa una terapia è necessario che il farmaco venga distribuito in tutti i punti, il virus garantisce proprio una grande distribuzione a qualsiasi tipo di cellula o tessuto.

Il sistema evolutivo

Esistono 6 regni e 3 domini.

I 6 regni

• Eubatteri
• Archeobatteri
• Protisti
• Piante
• Funghi
• Animali

I 3 domini

• Batteri
• Archea
• Eucarioti

Lezione 2

Le proteine: sono macromolecole coinvolte in varie funzioni biologiche, comprendendo attività come quelle che garantiscono al DNA di compiere le sue funzioni; pongono linee di base su come organizzare le macromolecole. Le macromolecole sono diverse tra loro, ma presentano meccanismi simili; hanno come molecola di base gli amminoacidi (basso peso molecolare) ed essi si associano tra di loro in modo preciso e ripetitivo. Il legame presente tra gli amminoacidi è quello covalente con liberazione di una molecola d’acqua (legame di condensazione).

Amminoacido

Gruppi molecolari fissi presenti nell’amminoacido:

• Gruppo COOH (carbossilico): l’amminoacido è una molecola che può ionizzarsi a seconda delle condizioni ioniche in cui si trova. Nell’immagine sopra il gruppo carbossilico si presenta nella sua forma carica perché al posto dell’anione ossigeno (O-) abbiamo “H” -> la sua condizione base è COOH (COO- oppure COOH).
• Gruppo amminico (NH₃): in forma ionizzata (acquisizione di un elettrone) -> NH₃ e forma non ionizzata/bruta -> NH₂.
• Idrogeno H.
• Gruppo R (radicalico) che varia a seconda della proteina (sempre).

Questi gruppi sono legati a C (CARBONIO ALPHA -> chiamato così perché C è centrale che lega 4 gruppi differenti e per tale motivo viene denominato centro di chiralità ovvero le proteine che si andranno a sovrapporre sono diverse per la variante R). Un amminoacido ha un carbonio centrale legato a 4 costituenti diversi tranne in un amminoacido in cui sono legati due idrogeni (la glicina). Tutti gli amminoacidi (aa) sono ripetitivi per gruppo carbossilico, amminico, H e ciò che cambia è il gruppo R che varia a seconda dell’amminoacido.

Glicina

20 amminoacidi naturali:

• Vengono sintetizzati direttamente dalle cellule e vengono assunti attraverso processi metabolici dall’esterno;
• Sono presenti nelle proteine;
• Gli amminoacidi sono divisi in gruppi che sono la conseguenza delle caratteristiche chimico-fisiche del gruppo R (variante):
• Amminoacidi non polari (alifatici)
• Aromatici (R ha anelli aromatici)
• Carichi positivamente: carica positiva o negativa -> condizioni ioniche
• Se prevale quella positiva (carica), l’amminoacido è basico;
• Se prevale quella negativa (carica), l’amminoacido è acido;
• In tal caso avrei un amminoacido non polare.
• Carichi negativamente
• Polari ma senza carica

In natura troviamo 20 tipi di amminoacidi ed essi sono utilizzati per sintetizzare le proteine. Le combinazioni degli amminoacidi in una catena polipeptidica vengono associate alle attività di sintesi, trascrizione e produzione delle proteine: il DNA nella struttura primaria (di base) ha le informazioni che consentiranno poi ad identificare quali saranno coinvolte nel legame peptidico;

Per misurare una molecola bisogna sfruttare le sue caratteristiche chimico-fisiche: in base al loro peso molecolare e la composizione dei suoi atomi (della molecola) possiamo misurarle grazie ad uno strumento ottico. Per le proteine si utilizza lo spettrofotometro e grazie ad esso possiamo sapere se in una miscela vi sono proteine e di che tipo sono quest’ultime. Lo strumento viene tarato per riconoscere specifiche proteine -> gli amminoacidi aromatici.

Nello spettrofotometro ho un raggio di luce e un prisma che cattura la luce e seleziona le lunghezze d’onda utili per lo studio delle proteine. Procedimento: il raggio luminoso (corrisponde ad una lunghezza d’onda specifica) va a colpire le molecole che saranno poi misurate. In seguito il raggio viene deviato e con un sistema elettronico consente di misurare questa deviazione e anche la quantità di molecole presenti. La lunghezza d’onda propria degli amminoacidi aromatici è 280 nm (principalmente triptofano e tirosina e la loro quantità permette di misurare le proteine di un sistema biologico) e altri amminoacidi hanno valori molto più bassi. Le proteine vengono misurate anche nel campo clinico per vedere la quantità di quest’ultime nel suo range di normalità (al di sotto o al di sopra di questo valore si parla di condizione patologica). Per avere una sola proteina devo innescare un meccanismo di purificazione dato da una successione di procedure: se io ho delle cellule in coltura, ne rompo poi le membrane tramite sollecitazioni meccaniche, le proteine presenti andranno nel liquido biologico e andranno a formare l’estratto cellulare. Dopo di ciò, attraverso una serie di procedure vengono allontanati gli acidi nucleici/carboidrati e lipidi facendo rimanere solo le proteine, ma ancora non siamo in presenza di una proteina singola. Da questo estratto proteico misuro le proteine presenti su di esso con lo spettrofotometro (di 280 nm di lunghezza d’onda). Se voglio sapere la quantità in percentuale di una proteina specifica devo fare altre analisi specifiche. Per gli acidi nucleici la lunghezza d’onda è di 260 nm.

Legame peptidico

Gruppo amminico e gruppo carbossilico con liberazione di H₂O (acqua). L’orientamento degli amminoacidi rimane lo stesso: si inizia da NH₂ -> C alpha -> COOH; il gruppo amminico all’inizio (NH₂) e il gruppo carbossilico (COOH). L’orientamento è fondamentale perché il legame peptidico nasce dalla reazione che si ha tra COOH e NH₂ (in particolare il legame si ha tra il C del COOH e dall’H del gruppo amminico). La molecola d’acqua che viene eliminata deriva dal gruppo ossidrile del COOH e dall’H del gruppo amminico, viene liberata e si forma un legame forte tra C-N, tale legame non comprende solo C-N ma coinvolge anche atomi vicini: quelli del doppio legame C=O e il legame N-H. Il legame presente crea una conformazione della molecola fondamentale per la struttura delle proteine.

Questo tipo di reazione si definisce polarizzata. Sono reazioni che richiedono energia e non sono spontanee nei sistemi biologici: gli enzimi in questo caso aiutano i processi biologici a realizzarsi e nel caso del legame peptidico l’enzima che aiuta i due amminoacidi a formare questa reazione è la peptidil-trasferasi. Non è una proteina, casus rarus, in quanto tutti gli altri enzimi sono anche proteine. La peptidil-trasferasi è un RNA ribosomiale (acido nucleico che riesce a svolgere la medesima funzione delle proteine quando esse sono enzimi). Il legame peptidico tra C-N è un legame forte, covalente, di condensazione (dallo stato aeriforme a quello liquido) con liberazione di molecola d’acqua. La reazione si presenta forte perché la sua energia risulta avere un carattere di doppio legame parziale: per convenzione un legame singolo si rappresenta con una stanghetta (-) tra due atomi invece se avessimo due stanghette (=) saremmo in presenza di un doppio legame. In altri casi possiamo avere un legame triplo con rappresentato tre stanghette e grazie alla nomenclatura IUPAC definiamo la struttura e le caratteristiche chimico-fisiche. Il legame è: rigido, planare e polare (l’energia di legame C-N presente è diversa rispetto a quella che troviamo nel classico legame singolo covalente tra C-N. Legame corto essendo più forte nelle molecole che vanno a formare gli amminoacidi). Questo fenomeno è possibile dalla parziale distribuzione delle 2 coppie di elettroni tra atomo di ossigeno carbossilico e azoto aminico. L’ossigeno acquista una carica parziale negativa, l’azoto una carica positiva parziale creando un dipolo elettrico.

• Troviamo delle molecole che per loro natura possono essere definite elettropositive o elettronegative:
• Posso avere carica negativa sull’ossigeno e carica positiva sul gruppo amminico (esempio);
• Tali atomi sono l’ossigeno (per definizione è negativo -> gruppo carbossilico) e l’azoto (per definizione è positivo -> gruppo amminico).

La carica positiva dell’azoto e quella negativa dell’ossigeno creano una delocalizzazione degli elettroni e per questo motivo non saranno fissi ma liberi di muoversi, come conseguenza: rafforzamento del legame peptidico. Questa delocalizzazione (chiamata anche risonanza) aumenta l’energia di legame tra C e N ed è per questo che viene classificato come uno dei legami più forti. Ricorda: Le proteine possono perdere la loro attività biologica ma non la sua struttura essendo molto stabili.

Il legame peptidico è rigido: associato al concetto del legame forte -> se è un legame ad alta energia dal punto di vista dinamico molecolare si presentano degli impedimenti. Bisogna immaginare le molecole come delle strutture dinamiche che possono orientarsi nello spazio per trovare sempre quel tipo di condizione favorevole che gli garantiscono: Stabilità; Non occupare allo stesso tempo molta energia -> minimo energetico.

L’entropia: assume quella conformazione che porta ad un punto di vista funzionale migliore (grandezza termodinamica che caratterizza la tendenza dei sistemi chiusi e isolati a evolvere verso lo stato di massimo equilibrio). Il minimo energetico obbliga le molecole a rimanere dentro certi limiti per cui in realtà le molecole trovano un compromesso tra quella che è la forma più consona all’attività biologica per mantenere questo minimo energetico di stabilità. Se io ho una situazione come nel legame peptidico dove vi è tantissima energia e in quel punto della molecola i movimenti sono poco permessi: abbiamo un’alta energia del legame che praticamente mantiene gli atomi quasi fermi (legame rigido).

In un disegno: Gli amminoacidi vengono rappresentati su due piani in cui ai vertici c’è il carbonio alfa e all’interno del piano trovo il carbonio con l’azoto che sono fissi perché non si possono muovere quindi vuol dire che se io ho 2 amminoacidi, questi non ruotano intorno al legame peptidico.

Lezione 3

Strutture amminoacido

• Primaria: sequenza lineare degli amminoacidi (numero ed ordine lineare nella direzione da N a C terminale);
• Secondaria: rotazione dell’amminoacido che danno origine alla formazione dell’Alfa elica e foglietto Beta (conformazione che assumono gli amminoacidi in alcune parti dello scheletro peptidico);
• Terziaria: ripiegamento della catena (legata alla funzione biologica)
• Quaternaria: associazione tra più catene (conformazione delle proteine con più subunità, ad esempio l’emoglobina);

La complessità della struttura dipende dalla necessità e funzione della proteina.

L’Alfa elica (struttura secondaria): Un’elica si genera quando una singola catena polipeptidica si avvolge su se stessa per formare un cilindro rigido ed essa è una struttura secondaria comune delle proteine. Il nome deriva dal fatto che gli amminoacidi si organizzano intorno ad un asse longitudinale immaginario formando questa struttura ad elica e le catene R degli amminoacidi sporgono verso l’esterno. L’Alfa elica è uno dei più stabili da un punto di vista energetico e termodinamico. La direzione della rotazione è destrorsa perché gli amminoacidi esistenti in natura sono tutti amminoacidi di natura L e il gruppo R che ruota intorno all’asse della proteina sta sempre all’esterno e in questo modo evitiamo...