Microbiologia, parte di Virologia

Microbiologia Professoresa Provvedi Roberta UNIPD (2° anno Biologia) (Virologia)

Introduzione alla virologia

La microbiologia è la scienza che studia la vita microscopica. Si divide in:

• Batteriologia - studia procarioti, batteri e archea
• Protozoologia - studia i protozoi
• Micologia - studia lieviti e muffe
• Virologia - studia i virus

Gli esseri viventi non si dividono solo in animali e piante; infatti, l'albero filogenetico è principalmente occupato dai procarioti, quindi batteri e Archea. La maggior quota di biomassa terrestre è composta da procarioti: sia come numero assoluto che come numero di specie, i procarioti sono molto più numerosi!

I microorganismi presenti nell'ambiente permettono la stimolazione del sistema immunitario, che deve "allenarsi come un muscolo": il sistema immunitario deve quindi entrare in contatto con questi microrganismi ambientali.

Abbastanza abbondanza di microrganismi

Perché i microrganismi sono così abbondanti sulla Terra? Qualsiasi sistema vivente prende energia e materia dall'ambiente e la trasforma in cellule e molecole complesse. Questo processo non può continuare all'infinito, perché le risorse non sono infinite. Quindi, dopo la morte di un organismo, la materia che lo compone viene riciclata grazie all'azione dei microrganismi: sono loro ad avere un ruolo predominante nell'operazione di mantenimento del ciclo vitale.

• Per questo motivo sono così presenti sulla superficie terrestre
• Per questo motivo abbiamo sviluppato un sistema immunitario, per evitare che riciclino la nostra materia

I microrganismi perciò sono fondamentali in ogni ciclo biochimico, come ad esempio il ciclo dell'azoto.

I virus e la loro presenza

Anche i virus sono presenti in altissima quantità:

• I virus infettano ogni forma vivente, ogni specie ha i propri virus specifici. Può capitare che questi virus specifici riescano a fare il "salto di specie" e colpire una specie diversa (come Covid, partito dai pipistrelli e HIV, partito dalle scimmie).
• Mangiamo e beviamo milioni di virioni, che possono essere usati anche volontariamente come additivi nel cibo, come ad esempio per preservare gli hot dog dalla loro degradazione. Inoltre, vengono usati come soluzione alle infezioni da parte dei microrganismi resistenti agli antibiotici.
• Alcuni genomi virali fanno parte del nostro corredo genetico e vengono fatti ereditare di generazione in generazione.

Da un punto di vista di biomassa, i procarioti sono i più abbondanti. Tuttavia, analizzando l'abbondanza, quindi il numero assoluto di individui presenti, il discorso cambia: i virus batteriofagi risultano essere i più abbondanti. In un litro di acqua marina costiera ci sono più virus di quante sono le persone sulla Terra. (Questi virus non causano malattie nell'uomo perché il nostro sistema immunitario li elimina e perché di base questi virus non sono in grado di entrare nelle nostre cellule per replicarsi)

Questo perché i virus contribuiscono a riciclare molecole biodisponibili che possono essere utilizzate come nutrienti da altre forme di vita: un batteriofago che infetta un batterio e lo lisa, va a rilasciare il contenuto citoplasmatico della cellula, che è ricco di molecole organiche che possono essere riciclate da altre forme di vita.

• I virus perciò hanno un importante ruolo ecologico, permettono di riciclare le molecole biodisponibili.

Infezioni virali permanenti

Alcune infezioni che subiamo una volta acquisite restano per tutta la vita, non possono essere eradicate:

• Herpes simplex (herpes labiale)
• Virus della varicella zoster
• Virus di Epstein-Barr (mononucleosi)
• Citomegalovirus (pericoloso per le donne in gravidanza)

Dimensioni e visibilità dei virus

I virus possono avere dimensioni e forme diverse. Solitamente sono visibili solo con il Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM). Esistono però virus, come il Pandoravirus, che risultano essere visibili al microscopio ottico. Il Pandoravirus è un virus delle amebe.

Struttura dei capsidi virali

I virus non vengono considerati come esseri viventi, ma come elementi genetici che possono esistere in due fasi differenti:

• Fase intracellulare
• Fase extracellulare o virione. È inerte, incapace di replicarsi in maniera autonoma.

Per poter ottenere una progenie virale, il virus deve entrare all'interno di una cellula ospite. Una volta al suo interno acquisisce la capacità di moltiplicarsi per generare una progenie. Essa fuoriuscirà per poi entrare in contatto con altre cellule ospiti e ripetere il ciclo replicativo.

L'interazione tra virus e cellula ospite avviene in seguito ad un riconoscimento specifico tra delle strutture specifiche presenti sulla superficie del virione e la superficie della cellula ospite.

I virus sono anche stati paragonati ai trasposoni, con l'unica differenza che necessitano di una "navetta" per il loro trasporto: nel caso dei virioni si parla di un involucro proteico che contiene il genoma virulento.

Tale involucro proteico è detto CAPSIDE. Tale capside può avere una struttura più o meno complessa che racchiude l'acido nucleico, DNA o RNA che sia, contenente l'informazione genetica del virus, denominata VIRIONE.

In alcuni casi il capside può essere rivestito da una membrana derivante dalle membrane fosfolipidiche delle precedenti cellule ospiti detta PERICAPSIDE o ENVELOPE. Il capside costituisce gran parte della massa virale. Può essere composto da una o più proteine differenti, organizzate tra loro in unità morfologiche dette CAPSOMERI.

Principi di formazione di un capside

Più elementi si associano per formare l'unità morfologica del capsomero. L'insieme di questi capsomeri permette la formazione del capside stesso.

I virus nudi sono quei virus caratterizzati dalla presenza di un capside e dal genoma. Un esempio è il poliovirus, un picornavirus.

I virus dotati di pericapside sono detti virus rivestiti. Un esempio è il virus dell'HIV. Il pericapside presenta delle glicoproteine virali, il capside è a forma di tronco di cono. Il NUCLEOCAPSIDE invece è il capside contenente il genoma virale.

Struttura del capside

Esistono tre tipi di simmetria del capside:

• Icosaedrica
• Elicoidale
• Complessa (parte elicoidale, parte icosaedrica)

NB: Questo numero ristretto di architetture proteiche è dovuto a limitazioni imposte da considerazioni di efficienza e stabilità. Queste architetture consentono a una o più proteine non simmetriche di assemblarsi assieme in maniera simmetrica per creare un contenitore che termodinamicamente richieda la minore quantità di energia possibile per formarsi e mantenersi.

Capside icosaedrico

Icosaedro: poliedro a 20 facce triangolari e 12 versi. Ha 3 assi di simmetria rotazionale. È la struttura con il più basso livello di energia, per questo i virus icosaedrici sono i più comuni. I capsidi della maggior parte dei virus sono sferici, ma le unità strutturali interagiscono tra loro mantenendo una simmetria icosaedrica.

• Il capside si genera dall'associazione dei capsomeri unità strutturali.
• I capsomeri sono formati dall'associazione dei protomeri, le subunità strutturali.
• I protomeri sono formati dall'associazione delle proteine, le unità base.

Nel caso dell'adenovirus i capsomeri si dividono in due tipi:

• Esoni: Sono formati da 6 protomeri, a loro volta costituiti da 2 tipi diversi di proteine.
• Pentoni: Ai vertici della struttura icosaedrica. Questo capside contiene 252 capsomeri: 240 esoni e 12 pentoni.

Capside elicoidale

La struttura è più semplice, ottenuta dall'associazione di subunità proteiche uguali per ottenere la forma elicoidale. Essa poi si associa al genoma del virus avvolgendolo. Questo tipo di capside è caratteristico dei virus con genoma costituito da RNA a singolo filamento.

Capside a struttura complessa

Caratteristico dei batteriofagi. Due sono gli elementi che lo caratterizzano:

• Un elemento a struttura icosaedrica che contiene il genoma virale.
• Una coda a simmetria elicoidale.

Poxviridae risulta essere differente. C'è un core che contiene il genoma sotto forma di DNA e degli enzimi virali che permettono il ciclo di replicazione. Il core è protetto da un involucro proteico a sua volta rivestito da due strati membranosi.

Definizioni

Proteine strutturali virali: Proteine che contribuiscono alla formazione della struttura capsidica. Si distinguono da quelle enzimatiche che possono comunque essere presenti a livello del virione.

La struttura del virione deve essere stabile nell'ambiente per garantire la protezione del genoma virale e quindi la sua trasmissione. La struttura di un virus è METASTABILE: in alcune situazioni risulta stabile, in altre no. Nell'ambiente esterno sarà stabile, all'interno della cellula ospite invece si destabilizza per rilasciare nel citoplasma il genoma virale.

Quando disperso nell'ambiente, il virione non si trova in uno stato di minima energia libera, perché nella fase di assemblaggio c'è un accumulo di energia che viene utilizzata per superare una barriera energetica sfavorevole per iniziare il disassemblaggio del capside una volta entrato nella cellula. Allora si raggiunge il livello minimo di energia. Questa barriera energetica sfavorevole impedisce al virione di disgregarsi spontaneamente nell'ambiente.

Come si crea la metastabilità?

• La struttura stabile si ottiene grazie ad un arrangiamento simmetrico di molte proteine identiche tra loro per consentire il livello massimo di coesione.
• La struttura instabile è dovuta al fatto che le proteine non sono legate covalentemente, per cui la struttura non è tenuta insieme in maniera permanente e quindi può essere smontata o allentata durante l'infezione per rilasciare o esporre il genoma.

La stabilità è quindi legata al loro aspetto simmetrico: la simmetria fornisce quindi le regole per l'autoassemblaggio.

1. Ogni subunità contatta quella adiacente mediante legami identici: le interazioni che si ripetono tra le superfici chimicamente complementari determinano per natura un arrangiamento simmetrico.
2. Queste interazioni non sono covalenti, quindi sono reversibili. Possono perciò essere corrette durante la fase di assemblaggio.

Le proteine del capside perciò si auto-assemblano nel citoplasma per formare dei capsidi privi di genoma, detti Virus-Like Particles (VLP). Vengono utilizzati per creare i vaccini, come ad esempio nel caso dell'epatite o del papilloma virus.

Struttura virioni

Virus di animali nudi

• Adenovirus
• Papillomavirus
• Picornavirus

I virus nudi di animali hanno capside SOLO icosaedrico.

Picornavirus: il capside è ottenuto attraverso l'associazione di 4 proteine che si associano in maniera da formare delle invaginazioni dette CANYON per prendere contatto con il recettore specifico che si trova sulla membrana della cellula bersaglio. In seguito all'interazione tra la proteina L1 del capside e il recettore cellulare, la proteina va incontro ad un cambiamento conformazionale tale che ha la possibilità di inserirsi all'interno della membrana cellulare per permettere il passaggio del genoma virale all'interno della cellula ospite.

Papillomavirus: ha un'organizzazione icosaedrica con unità strutturali a pentoni ed esoni. Il capside è formato dall'associazione di due diverse proteine. Il genoma contenuto al suo interno è un DNA bicatenario associato ad istoni. La proteina L1 permette di prendere contatto con il recettore cellulare sulla cellula bersaglio. A questo punto il capside si allenta e viene esposta la proteina L2, che può essere processata dalla furina presente sulla membrana della cellula bersaglio: ciò porta all'avvio del processo di endocitosi con il quale il virus entra all'interno della cellula. Nell'endosoma inizia un processo di acidificazione che porta alla disgregazione del capside. L2 resta associata al genoma, che quindi può essere guidato nell'RE e successivamente nel nucleo per iniziarne la replicazione. Ciò è possibile perché L2 contiene le sequenze segnale che permettono il trasporto del genoma nel nucleo.

Adenovirus: grandi dimensioni. Il capside è formato da diversi tipi di proteine che si associano per formare pentoni ed esoni. Inoltre ci sono altre proteine strutturali associate al capside. Anche in questo caso si parla di genoma a DNA bicatenario.

Virus animali con pericapside

• Orthomyxovirus (influenza)
• Herpesvirus
• HIV

Questi virus possono presentare un nucleocapside con simmetria elicoidale o icosaedrica.

Orthomyxovirus: costituito da un pericapside derivante dalle membrane della cellula nella quale il virus si è precedentemente replicato (in quanto i virus NON sono in grado di sintetizzare i lipidi). Su questa membrana sono posizionate delle glicoproteine di due tipi: emaglutinina (associazioni di 4 glicoproteine uguali) e neuroaminidasi (associazione di 3 glicoproteine uguali).

Le glicoproteine del pericapside possono quindi associarsi in complessi multiproteici denominati SPICOLE o PEPLOMERI. Il pericapside si poggia su una matrice di natura proteica nella quale sono contenuti i nucleocapsidi, che possono essere 7 o 8 a seconda del tipo di virus influenzale: il suo genoma a RNA a singolo filamento è segmentato in 7/8 segmenti diversi, ognuno dei quali è avvolto da un nucleocapside elicoidale. Il virus dell'influenza esiste in tre forme:

• Tipo A
• Tipo B
• Tipo C

A e B hanno un genoma costituito da 8 segmenti. sono responsabili delle epidemie stagionali. C ha un genoma costituito da 7 segmenti.

HIV: le sue spicole sono ottenute dall'associazione di glicoproteine diverse tra loro. È dotato di un pericapside che poggia su una matrice di natura proteica che racchiude un capside a tronco di cono. Esso racchiude due nucleocapsidi. Il genoma dell'HIV è a RNA ed è presente in due copie identiche, è un genoma diploide contenuto in due nucleocapsidi elicoidali. Le glicoproteine del pericapside sono ottenute dall'associazione di due proteine: gp120 (esterna) e gp41 (inserita nella membrana del pericapside). Permettono al virus di legarsi ad un recettore specifico, detto cd4, presente nei linfociti t4. In seguito all'interazione tra gp120 e cd4 ci sono dei cambiamenti conformazionali che determinano la fusione tra membrana del pericapside e membrana cellulare, così da immettere il genoma del virus nel citoplasma della cellula bersaglio.

Herpesvirus: il virione ha un capside icosaedrico che contiene il genoma, ed è immerso in un tegumento di natura proteica su cui poggia il pericapside. Le glicoproteine che poggiano sul pericapside sono diverse; le spicole sono tutte diverse tra loro.

Filomiridae: Ebovavirus fa parte dei Filomiridae. Ha un genoma ad RNA a singolo filamento a polarità negativa, protetto da un capside elicoidale. Il tutto è protetto da un pericapside in cui sono inserite le proteine di superficie usate dal virione per entrare in contatto con la cellula ospite. Presenta una RNA polimerasi RNA-dipendente associata al genoma per permettere al genoma stesso di replicarsi. Questa proteina non è presente nella cellula ospite, in quanto l'essere umano presenta RNA polimerasi DNA-dipendenti, quindi il virus la porta con sé. (La stessa cosa vale per i virus dell'influenza)

Coronavirus: virione dotato di pericapside che presenta spicole formate da trimeri di glicoproteina S che circonda il virione in modo da sembrare una corona dall'alto. Inoltre è presente la glicoproteina M che interagisce con il nucleocapside elicoidale e la envelope protein, glicoproteina E, necessaria per il rilascio del virus dalla cellula ospite. Anche il coronavirus necessita di una RNA polimerasi RNA-dipendente, ma in questo caso l'RNA del genoma è a polarità positiva.

Replicazione dei virioni

Il ciclo di replicazione virale si divide in varie parti:

• Adsorbimento della particella virale da parte dell'ospite
• Penetrazione del virione nella cellula
• Scapsidazione, rimozione delle proteine del capside per liberare il genoma
• Sintesi virale (trascrizione e traduzione delle proteine virali, e replicazione del genoma virale)
• Assemblaggio del virus
• Liberazione di nuovi virus

I virus sono considerati dei parassiti cellulari obbligati in quanto hanno necessità di entrare all'interno di una cellula per potersi replicare: infatti non presentano ribosomi per la sintesi proteica.

Adsorbimento

Le particelle virali sono troppo grandi per potersi diffondere attraverso la membrana citoplasmatica, quindi devono avere modalità particolari per penetrare nella cellula.

1. Il virus aderisce in maniera elettrostatica alla superficie cellulare > interazione aspecifica.
2. Il virus attacca i recettori cellulari attraverso specifici ligandi virali detti antirecettori > interazione specifica.
3. Il nucleocapside del virus viene trasferito all'interno della cellula.

I recettori cellulari sono sostanze di varia natura (glicoproteine, proteine, carboidrati) esposti sulla superficie cellulare. Normalmente sono necessari per lo svolgimento delle funzioni fisiologiche della cellula. Vanno a determinare lo spettro d'ospite del virus: il virus dell'epatite ad esempio può infettare solo gli epatociti in quanto presentano sulla loro membrana delle componenti che reagiscono in maniera specifica con i componenti espressi sulla superficie del virus.

Questi recettori sono essenziali per tutti i virus ad eccezione di quelli di funghi e piante in quanto rispettivamente non hanno una fase extracellulare o entrano in seguito ad