Microbiologia (Parte di batteriologia)

Batteriologia Prof. Roberta Provvedi

Morfologia delle cellule procarioti

Membrana plasmatica dei procarioti

Il materiale genetico dei procarioti è costituito da un unico cromosoma circolare avvolto attorno a proteine, simili agli istoni eucariotici, a formare un complesso detto nucleoide. Differentemente dal nucleo, non è avvolto da una membrana: è immerso nel citoplasma contenuto nella membrana citoplasmatica. La membrana citoplasmatica è avvolta dalla parete cellulare, che a sua volta può essere circondata da un involucro esterno, la capsula. Alle cellule eucarioti possono essere associati pili e flagelli.

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica presenta delle differenze a seconda che si analizzino Bacteria o Archea.

• Nei Bacteria la membrana è costituita da un doppio strato fosfolipidico, ma a differenza degli Eucarioti non presenta colesterolo ma l'opanoide, un composto ottenuto dagli stessi precursori del colesterolo. Gli opanoidi servono per conferire stabilità alla membrana citoplasmatica, mantenere l'integrità e stabilità della membrana.

La membrana svolge molteplici funzioni metaboliche:

• Respirazione cellulare
• Fotosintesi
• Sintesi di costituenti cellulari

La membrana presenta un'organizzazione a mosaico fluido. Presenta numerose proteine di membrana, molte più rispetto agli eucarioti, in quanto svolge anche le funzioni che negli eucarioti sono attribuite ad organelli come mitocondri e cloroplasti. Le proteine presenti possono essere integrali, con porzioni idrofobiche che le associano stabilmente alla parete, o proteine periferiche debolmente associate alla membrana. I fosfolipidi che compongono la parete sono generalmente la fosfatidilserina e la fosfatidiletanolamina. Esse possono legarsi a gruppi funzionali diversi. Gli steroli generalmente sono assenti nei batteri, al loro posto ci sono gli opanoidi. (NB: Nel caso in cui i microrganismi necessitino di un ospite per la loro replicazione, allora la membrana conterrà colesterolo).

• Negli Archaea la membrana citoplasmatica è composta da catene di idrocarburi uniti al glicerolo mediante legami etere. Sono catene poli-isopreniche a 20 atomi di carbonio, dette fitanile, o 40 atomi di C, bifitanile. Le fitanile si assemblano a formare un doppio strato per formare la membrana citoplasmatica. In alcuni casi però è costituito un unico strato, formato da bifitanile (negli Archaea ipertermofili). Al posto degli opanoidi si possono formare delle strutture ad anello detti ciclopentanici che conferiscono stabilità alla membrana citoplasmatica.

La fluidità della membrana può cambiare a seconda delle diverse condizioni ambientali, soprattutto nei procarioti (negli organismi a sangue caldo l'ambiente resta sempre costante, quindi la fluidità non varia molto). Gli opanoidi (e il colesterolo) permettono di variare la fluidità della membrana a seconda della temperatura:

• Gli acidi grassi presenti nella membrana dei batteri sono in maggioranza saturi. Il rapporto acidi grassi saturi/insaturi influenza il grado di fluidità della membrana: i doppi legami presenti nelle catene lipidiche ne diminuiscono la viscosità. Il grado di saturazione può variare in risposta a stimoli ambientali - l'aumento di temperatura porta ad un allontanamento delle catene degli acidi grassi.

Con la riduzione della temperatura il funzionamento delle proteine strutturali che compongono la membrana non è efficace in quanto la fluidità della membrana stessa si riduce. Per questo motivo è necessario aumentare tale fluidità attraverso l'utilizzo di alcuni enzimi che portano alla formazione di doppi legami a livello degli acidi grassi saturi, che quindi si distanziano tra loro: si garantisce quindi fluidità anche in presenza di basse temperature. Se invece la temperatura è troppo alta, gli acidi grassi con doppi legami vengono chimicamente modificati a saturi in maniera tale da ridurre la fluidità della membrana e permetterne il corretto funzionamento.

Corpi di inclusione citoplasmatici

Citoplasma

Il citoplasma delle cellule procarioti è estremamente denso: presenta il nucleoide, molti ribosomi, varie proteine periferiche e mRNA, che generano una pressione osmotica molto superiore rispetto a quella generata dal citoplasma degli eucarioti. Per accumulare sostanze di riserva senza andare ad aumentare ancora la pressione osmotica del citoplasma i batteri hanno sviluppato alcuni escamotage: i corpi di inclusione.

I corpi di inclusione sono accumuli di materiali, possono avere un ruolo di riserva, accumulando sostanze al loro interno o svolgere funzioni particolari, come nel caso di magnetosomi e carbossisomi.

I corpi di inclusione possono essere di natura lipidica (poli-β-idrossibutirrato) e essere simili a gocce. Possono contenere glicogeno, fosfato, zolfo, …. Il poli-β-idrossibutirrato (PHB) è costituito da polimeri di acido butirrico legati assieme attraverso un legame estere e formano dei granuli compattati attraverso uno strato membranoso. I granuli di PHB vengono sintetizzati quando il C è in eccesso nell'ambiente in cui si sviluppano, e vengono utilizzati come fonti di carbonio nei processi biosintetici o per produrre ATP.

I granuli di polifosfato invece possono essere degradati e usati come sorgente di fosfati per la sintesi di acidi nucleici e fosfolipidi necessari per la crescita della cellula. I granuli di glicogeno vengono anch'essi usati come riserva e fonte di C.

Nei cianobatteri si formano anche granuli di cianoficina, un polimero composto da acido aspartico e arginina, utilizzato come fonte di azoto. I carbossisomi svolgono una funzione diversa da quella di riserva. Hanno forma poliedrica e sono dei distretti microcellulari dove vengono accumulati enzimi per la fissazione della CO₂, furono scoperti per la prima volta nei cianobatteri. I magnetosomi invece sono corpi di inclusione presenti nei batteri che vivono in ambienti marini. Sono ricchi di magnetite, grigite e pirite. Sono delimitati da un mono-strato fosfolipidico che presenta delle proteine che permettono la precipitazione della magnetite a partire dallo ione ferrico Fe³⁺. Aiutano i microrganismi ad orientarsi secondo le linee del campo magnetico terrestre: si parla di magnetotassi. In questa maniera le cellule batteriche si dirigono verso i sedimenti, verso zone ricche di nutrienti nel fondo degli oceani.

Strutture analoghe ai magnetosomi sono presenti anche nel capo di delfini ed uccelli. Le vescicole gassose sono delle strutture costituite da proteine idrofobiche che contengono gas ed escludono i liquidi: aiutano il batterio a posizionarsi lungo la colonna d'acqua in maniera tale da favorire la cattura dell'energia luminosa. Sono presenti nei cianobatteri. Due sono le proteine che compongono le vescicole gassose: GvpA e GvpC.

• GvpA è la più abbondante, è piccola, rigida ed altamente idrofobica.
• GvpC è meno abbondante e stabilizza l'interazione tra le varie unità di GvpA.

Parete cellulare

La parete cellulare è una struttura rigida ma elastica ed estendibile all'esterno della membrana plasmatica. Quasi tutti gli Eubatteri presentano la parete cellulare. Svolge molte funzioni:

• Contribuisce a dare forma alla cellula
• Impedisce la lisi osmotica
• Fa da filtro per il passaggio di sostanze

È un elemento fondamentale per la sopravvivenza del batterio: infatti i farmaci antibatterici vanno a colpire la parete batterica e provocano la morte del batterio stesso. La parete conferisce rigidità alla cellula e contiene la pressione osmotica del citoplasma, che essendo molto denso presenta una pressione osmotica elevata: nel momento in cui la parete viene rotta, la membrana citoplasmatica NON è in grado di contenere tale pressione, quindi va incontro a lisi. La parete batterica è composta da peptidoglicano, formato da subunità monomeriche tutte identiche. Ognuna di esse è composta da due aminozuccheri:

• N-acetilglucosamina
• Acido N-acetil-muramico

I due aminozuccheri NAG e NAM sono tenuti assieme attraverso un legame β 1->4 glicosidico sintetizzato attraverso delle transglicosilasi. Tale legame è bersaglio dei lisozimi per provocare la distruzione della parete cellulare e quindi la morte del batterio stesso. I lisozimi sono presenti anche nel nostro organismo, come nella saliva e negli occhi (liquido lacrimale) - per questo motivo gli occhi sono l'unico distretto corporeo che risulta essere sterile nonostante siano a contatto con l'ambiente esterno, non sono colonizzati da microrganismi. Le altre mucose invece sono rivestite da batteri e vanno a comporre il microbiota umano, importante per il corretto funzionamento fisiologico dell'organismo (ad esempio potenzia il sistema immunitario).

L'unità monomerica di peptidoglicano, oltre ad essere composta dai due aminozuccheri, presenta una catena tetrapeptidica (composta da quattro amminoacidi) attraverso la L-alanina che si lega al gruppo carbossilico dell'acido lattico del NAM. I 4 amminoacidi alternano tra loro la conformazione L e D:

• L-Alanina
• Acido D-Glutamico
• Acido meso-diamino-pimelico (DAP) nei Gram negativi, L-Lisina nei Gram positivi
• D-Alanina

La conformazione D- aumenta la resistenza del peptidoglicano contro le proteasi che lo andrebbero a rompere. Queste catene polimeriche si intrecciano formando un reticolo che avvolge la superficie della membrana citoplasmatica. Il reticolo può essere presente in più strati. L'interazione tra le varie catene è permessa attraverso le catene tetrapeptidiche - la catena tetrapeptidica di un filamento prende interazione con la catena tetrapeptidica di un altro filamento:

L'interazione avviene sempre tra l'ultima D-Alanina e il terzo peptide della catena tetrapeptidica adiacente e parallela: legami crociati. NB: il gruppo COOH della D-Alanina può essere collegato o al gruppo NH del DAP dei gram negativi, o all'NH della L-Lisina dei gram positivi attraverso l'azione dell'enzima transpeptidasi.

Nello Staphylococcus aureus, batterio Gram positivo, la L-Lisina in posizione tre della catena tetrapeptidica interagisce con la D-Alanina in posizione 4 di un'altra catena per azione di un ponte di 5 glicine: la rete risulta quindi essere composta da catene parallele legate tra loro mediate glicine. I filamenti di peptidoglicano formano delle catene elicoidali con le catene peptidiche orientate esternamente per prendere contatto con le catene limitrofe. Il numero di unità monomeriche in una catena di peptidoglicano può variare in base alle dimensioni della cellula: ad esempio nel Bacillus sono 50-250, in S. aureus 18.

Biosintesi del peptidoglicano

Si articola in tre parti e in tre distretti cellulari differenti:

• A livello del citoplasma avviene la sintesi dei precursori, ovvero NAG NAM e una catena pentapeptidica.
• A livello della membrana citoplasmatica avviene la sintesi dell'unità monomerica.
• A livello dello spazio extracitoplasmatico avviene la polimerizzazione e transpeptidazione delle unità monomeriche, c'è quindi la sintesi delle catene polimeriche attraverso l'uso di transglicosilasi che formano i legami β 1->4 e transpeptidasi che formano i legami crociati.

La catena pentapeptidica diverrà una catena tetrapeptidica con la formazione dei legami crociati: per la formazione dei legami crociati è necessario utilizzare energia. Tale energia è prodotta attraverso la rottura dell'ultimo amminoacido presente nella catena pentapeptidica, una D-Alanina. La produzione di catene polimeriche avviene nel momento della divisione cellulare: la cellula deve accrescersi prima di separarsi, quindi i nuovi filamenti di peptidoglicano prodotti vengono inseriti all'interno del reticolo di peptidoglicano già presente. Si devono perciò compiere delle rotture a livello del reticolo per permettere l'entrata delle nuove catene: tale rottura è catalizzata da delle autolisine, poi le transpeptidasi catalizzano la formazione dei legami crociati.

Le autolisine oltre a creare i tagli nel peptidoglicano per permettere l'inserimento dei filamenti neosintetizzati, servono anche nel turn-over del peptidoglicano, il rinnovamento della parete durante la vita della cellula batterica. Inoltre queste autolisine permettono l'apertura di spazi dove inserire flagelli, pili e sistemi di secrezione. Molte proteine coinvolte nella sintesi del peptidoglicano sono dette PBP (Penicillin Binding Protein), per la loro capacità di legare l'antibiotico penicillina, che attraverso questo legame le va a bloccare, così viene impedita la sintesi del peptidoglicano e porta alla lisi del batterio.

Gram positivi e Gram negativi

Gli Eubatteri si dividono in Gram positivi e Gram negativi. Questa divisione dipende dalla diversa modalità con cui questi microrganismi si colorano con la colorazione di Gram. Le cellule batteriche vengono colorate con il cristalvioletto, ed agisce su entrambi i tipi. Usando poi un decolorante il cristalvioletto viene eliminato solo nei Gram negativi: ciò dipende dalla diversa struttura delle due superfici batteriche. Usando poi un colorante di contrasto i Gram negativi appariranno rossi, mentre i Gram positivi appariranno viola a causa del cristalvioletto.

I Gram positivi comprendono:

• Bacilli: Bacillus subtilis
• Stafilococco: Staphylococcus aureus
• Clostridium
• Enterococcus fecalis (microbiota intestinale)
• Streptococco: Streptococcus pneumoniae

I Gram negativi comprendono:

• Salmonella
• Bordetella (pertosse)
• Nesseria (Meningite)
• Vibrio colerae (colera)
• Helicobacter (gastriti)
• Pseudomonas

Parete dei Gram positivi

La parete dei Gram positivi è costituita da uno spesso strato di peptidoglicano, che può occupare anche il 40% del peso secco della cellula. Ad esso sono associate delle strutture denominate acidi teicoici e acidi lipoteicoici. Gli acidi teicoici si legano in maniera covalente al peptidoglicano a livello del C6 del NAM, mentre gli acidi lipoteicoici attraversano tutto lo strato e si legano alla membrana citoplasmatica attraverso un'ancora glicolipidica.

Acidi teicoici: polimeri anionici contenenti glicerolfosfato e ribitolfosfato. Generalmente si legano ad amminoacidi come la D-alanina. Essendo ricchi di fosfato fanno da riserva e da fonte di fosfato sotto forma di granuli quando si trovano in un ambiente povero di tale elemento: donano il fosfato e vengono sostituiti da composti privi di P, gli acidi teicuronici. A causa di questo fosfato assumono una carica negativa - la superficie perciò presenta una carica negativa.

Questi acidi contribuiscono al passaggio di ioni attraverso la membrana cellulare (Ca²⁺ e Mg²⁺) in virtù della loro carica negativa. Gli acidi teicoici oltre ad alimentare il passaggio di ioni e fare da riserva di fosfato vanno a favorire l'adesione della cellula batterica ad una superficie tissutale. Ad esempio in Staphylococcus aureus questi acidi permettono di aderire alla mucosa nasale.

A livello della parete ci sono anche delle proteine di parete che si legano al peptidoglicano mediante legami covalenti e non. Queste proteine svolgono varie funzioni:

• Contribuire a far aderire la cellula batterica ad una superficie (adesine).
• Interazione tra cellula batterica e ambiente/ospite.
• Difesa verso il sistema immunitario dell'ospite.
• Sintesi e ricambio del peptidoglicano (autolisine, transpeptidasi).

Parete dei Gram negativi

Lo strato di peptidoglicano è molto più sottile e si ritrova tra due membrane: membrana citoplasmatica (presente anche nei Gram positivi) e membrana esterna (peculiare di questi batteri). La membrana esterna è una struttura asimmetrica con composizione chimica diversa da quella della membrana citoplasmatica. È un doppio strato fosfolipidico, ma:

• Lo strato interno contiene gli stessi fosfolipidi della membrana citoplasmatica
• Lo strato esterno oltre a contenere i "fosfolipidi canonici" contiene dei polisaccaridi detti lipopolisaccaridi.

Lo spazio compreso tra membrana esterna e membrana citoplasmatica e contenente il peptidoglicano è detto periplasma. La membrana esterna è legata allo strato di peptidoglicano attraverso le lipoproteine di Braun. Queste lipoproteine permettono l'ancoraggio attraverso il gruppo COOH dell'acido meso-diamino pimelico (DAP) con un legame peptidico. Il componente più caratteristico della membrana esterna è il lipopolisaccaride (LPS), e si ritrova sul foglio esterno della membrana esterna.

Lipopolisaccaride, porine e periplasma

Lipopolisaccaride

Il lipopolisaccaride è una struttura lipidica che contiene anche carboidrati e gruppi fosfato. Si articola in tre parti:

• Lipide A, che fa da ancora della membrana esterna
• Core, la parte centrale di natura polisaccaridica
• Catena laterale O, o antigene O-specifico, di natura polisaccaridica.

Lipide A: fosfolipide caratterizzato da acidi grassi a lunga catena comuni a quelli dei fosfolipidi di membrana. Sono legati a glucosamina-fosfato attraverso un legame estere-aminico. Il numero di catene associate a questo disaccaride varia tra 4 e 7. Al glucosamino-fosfato è legato il core. Il lipide A è anche detto endotossina, infatti quando non è associato alla membrana esterna attiva la risposta infiammatoria in un ospite, ha perciò un'attività tossica. È detto endotossina in quanto è un componente strutturale della cellula batterica.