Farmacologia medica generale - I semestre

Farmacologia medica III anno

Indice

• Lez 1, 2: I bersagli molecolari, i recettori, recettori accoppiati a G protein
• Lez 3, 5: Recettori intracellulari
• Lez 4: Metabolismo per gli xenobiotici - Il ruolo dei recettori nucleari
• Lez 6, 10: Recettori canale
• Lez 8: Recettori per fattori di crescita
• Lez 9: Canali ionici voltaggio-dipendenti
• Lez 7, 17: Pompe e trasportatori
• Lez 16: Farmacologia dell'ossido nitrico
• Lez 22: La cascata dell'acido arachidonico
• Lez 11, 12: La sinapsi, i neurotrasmettitori
• Lez 13: I neurotrasportatori
• Lez 14, 23, 24: Modelli animali per patologie del SNC, fasi della ricerca e sviluppo di un farmaco
• Lez 17 18: Interazioni farmaco-recettore e risposta quantitativa ai farmaci
• Lez 19: Desensitizzazione e biased agonism
• Lez 15: Cellule staminali e medicina rigenerativa
• Lez 20: Generazione di topi knock-out e knock-in
• Lez 21: Farmaci biologici

La farmacologia è il campo che ha ricevuto i maggiori profitti dallo sviluppo delle biotecnologie (nuovi farmaci, tecnologie). Es.: Il GH prima era estratto dall’ipofisi dei cadaveri, oggi si produce. È importante comprendere come i farmaci, vecchi e nuovi, possono essere utilizzati nei pazienti.

I bersagli molecolari

Lezione 1, 2 Fornasari

I farmaci funzionano perché interagiscono con dei bersagli → bersagli molecolari dell’azione dei farmaci, ne modificano gli effetti, l’attività. I farmaci per funzionare devono interagire con i bersagli molecolari (ligandi) secondo le leggi d’azione delle masse, della chimica e della fisica.

→ Legge d’azione delle masse: teoria di occupazione: se vengono occupati tanti recettori (massa di ligando) con buona affinità si ottiene un risultato biologico importante. Senza conoscere i meccanismi patogenetici delle malattie, di cui si occupa la ricerca di base, non si può disegnare o concepire un farmaco che interferisca con quei meccanismi.

NB.: I farmaci non creano nessuna nuova funzione ma modificano funzioni preesistenti potenziandole o inibendole. = molecola endogena che lega il recettore o il farmaco (esogeno). ❖ Ligando

Es.: Placca muscolare: nicotina (farmaco, esogeno) può mimare l’azione dell’acetilcolina (endogeno). NB.: Omeopatia si fonda su un principio non scientifico: si diluisce fino al numero di Avogadro e si sostiene che il risultato non ha effetti avversi ma biologici. Ipotesi (di Benveniste) → per spiegare il funzionamento dell’omeopatia sviluppa la “Memoria dell’acqua” secondo la quale l’acqua rimane impressionata dalla molecola che poi non c’è più e mantiene una conformazione simile a quella del farmaco ed è in grado di stimolare il recettore.

I bersagli molecolari dell’azione dei farmaci sono molti ma non infiniti, sono circa 500 (numero definito in seguito al Progetto Genoma Umano, oggi un po’ di più). Un bersaglio molecolare può anche non essere drugable (“non oggetto della produzione di farmaci”). Es.: Bersagli non inibibili o che per raggiungerli è necessario attraversare la barriera emato-encefalica...

Tra i più importanti bersagli molecolari dei farmaci ci sono:

• I recettori di membrana, 45%, sono le “antenne paraboliche” attraverso le quali le cellule sono in contatto con il mondo esterno
• I recettori nucleari, 2% (oggi un po’ di più), tra i quali quelli per gli ormoni steroidei (corticosteroidi, estrogeni…)
• Enzimi, 30%, come ciclossigenasi, statine (inibitori HMG-CoA reduttasi che porta la sintesi del colesterolo), ATPasi...
• Canali ionici, 5%, come la lidocaina (anestetico locale che agisce bloccando i canali del sodio voltaggio-dipendenti)
• DNA, 2%, come alcuni chemioterapici, oligonucleotidi
• Ormoni e fattori, 11%, come eritropoietina, fattore della crescita, fattore VIII, insulina biotecnologica, agiscono come “rimpiazzo”
• Sconosciuti, 7%, come il dimetilfumarato, farmaco usato per il trattamento della sclerosi multipla (scoperto per psoriasi negli anni ‘50)
• Pompe trasportatori, ATPasiche, pompa K-protoni, pompa Na-K ATPasi, trasportatori coinvolti nella trasmissione sinaptica a livello del SNC.

I recettori

= Molecola (generalmente proteica) che ha associato un meccanismo di trasduzione del segnale, ❖ Recettore che provoca quando legato una risposta all’interno cellula.

Es.: Albumina non è un recettore perché trasporta anche farmaci ma non ha un meccanismo di trasduzione del segnale.

Esistono due classi:

• Recettori di superficie, di membrana
  • Sono proteine integrali della membrana plasmatica con una porzione extracellulare, una intracellulare e una transmembrana. Legano generalmente ligandi idrofilici (neurotrasmettitori classici e peptidici, fattori di crescita, citochine…). Trasducono il segnale generando modificazioni biofisiche e biochimiche della cellula.
  • Si dividono in tre classi:
    • Recettori canale: Canali ionici attivati (= il ligando determina una modificazione conformazionale del recettore che passa da uno stato inattivo ad attivo) da ligando. La trasduzione del segnale, e quindi l’effetto biologico, la risposta tissutale avviene in millisecondi sono infatti coinvolti in processi estremamente rapidi (SNC, placca neuromuscolare…).
    • Recettori accoppiati a G proteine: Le proteine G sono mediatori tra l’effettore e il recettore stesso. La risposta tissutale prende secondi (funzioni non da espletare immediatamente). 1000 geni nel nostro organismo sono codificanti per recettori accoppiati a G protein.
    • Recettori con attività enzimatica intrinseca: Recettori tirosin chinasici, con attività guanilato ciclasica intrinseca, fosfatasica… La risposta tissutale avviene in minuti (coinvolti in infiammazione, replicazione cellulare…). Le tre classi hanno in comune delle strutture molecolari.
• Recettori intracellulari
  • Sono all’interno della cellula a livello citoplasmatico o nucleare, sono fattori di trascrizione indotti da ligando, che li attiva. Legano sostanze lipofiliche che possono attraversare la membrana plasmatica, di solito trasportate da proteine carrier come albumina o, più specifiche, come cortisolo.
  • Impiegano ore per agire perché vanno a modulare l’espressione genica. Ci sono risposte anche non genomiche, un esempio sono le risposte per gli ormoni steroidei (di solito entro i 30 minuti).

NB.: In biologia e medicina è importante capire in quanto tempo i fenomeni avvengono. I recettori, come gli enzimi, sono proteine allosteriche che possono modificare la loro conformazione aperta-chiusa. Il ligando promuove la conformazione attivata della proteina.

Jacob e Monod hanno scoperto l’allosteria nei microrganismi tramite lo studio dell’Operone Lac (lattosio). Il recettore può poi risultare desensitizzato e down-regolato:

• Stato inattivato: ligando legato al recettore troppo a lungo o in concentrazioni molto elevate porta uno stato chiuso.
• Stato desensitizzato in seguito ad una stimolazione eccessiva, abnorme (es.: nel muscolo si ottiene una situazione di tetano).

Il recettore può poi essere internalizzato e degradato nei lisosomi.

Recettori canale

Canali ionici attivati da ligando. Costituiti da singole subunità poste intorno al canale ionico che attraversano la membrana 4 volte. Di queste la subunità M2 si interfaccia con le altre M2 per formare il canale.

Esistono diversi tipi di canali ionici: voltaggio-dipendenti (K, Na, Ca…), attivati dal voltaggio (la modificazione conformazionale che li fa aprire è il voltaggio), attivati da ligando (il quale impartisce la modificazione).

Si distinguono in:

• Permeabili ai cationi
  • Recettore dell’acetilcolina (recettore nicotinico muscolare e neuronale) della placca neuromuscolare (sono anche nei gangli del SNA simpatici e parasimpatici, nel SNC -effetti nicotina e dipendenza-). Sono stati i primi isolati e clonati!
  • Recettori glutammatergici ionotropi (portano ioni) o metabotropi (accoppiati a G protein) per il glutammato → (sia recettori canale che accoppiati a G protein un unico neurotrasmettitore usato per stimolare due classi differenti di recettori).
  • Recettore 5HT3 per la serotonina (in tutto sono 7, questo è canale, gli altri metabotropici).
  • Recettori purinergici per l’ATP: ATP è neurotrasmettitore coinvolto in moltissimi processi a livello del SNC. Nel midollo spinale è coinvolto nei processi di elaborazione del dolore. Non ci sono farmaci ma alcuni in pre/trials clinici per bloccanti di questi recettori. Se stimolati in maniera prolungata da canali diventano pori che fanno passare nella cellula un’enorme quantità di ioni, compreso calcio.
  • Recettori aperti da nucleotidi ciclici.
• Permeabili agli anioni
  • Recettori del GABA (ionotropici questi ma ci sono anche metabotropici) sono canali per il cloro, il quale se entra all’interno della cellula la iperpolarizza (potenziale intramembranario diventa negativo). Sono i più importanti recettori sinaptici per l’attività inibitoria. Il GABA a ha la funzione di reprimere l’attività elettrica del SNC. I barbiturici possono stimolare il recettore del GABA in eccesso in chi li assume in overdose e portare ad arresto respiratorio.
  • Recettore glicinergico per la glicina: implicati nell’inibizione, presenti nel tronco celebrale e controllano la respirazione. La stricnina in passato era l’unica molecola conosciuta in grado di agire sulla glicina, determina la morte di chi la assume molto rapidamente per arresto respiratorio.

Casi particolari: es.: calcio = catione bivalente. Questa divisione è possibile grazie agli amminoacidi presenti nel canale, che possono essere carichi positivamente o negativamente.

Recettori accoppiati a G protein

Sono monomeri che attraversano la membrana plasmatica 7 volte recettori a 7 domini transmembrana o accoppiati a G proteine. Sono monomeri (in vivo funzionano sotto forma di dimeri) che hanno:

• Una porzione extracellulare glicosilata;
• Una porzione intracellulare estesa che è area di interazione con la G proteina e di modulazione (presentano numerosi siti di fosforilazione, con sequenze consensus che presentano aa specifici, per il riconoscimento da parte di diverse chinasi fosforilazione in serina-treonina e in tirosina);
• Porzione transmembrana con 7 domini recettori a 7 domini transmembrana.

Esistono 1200 geni nel nostro genoma codificanti per altrettanti recettori accoppiati a G protein sistema di comunicazione usato moltissimo nell’evoluzione. Le vie gustative ed olfattorie utilizzano questi recettori. Il primo recettore accoppiato a G protein isolato è stato quello per i fotoni, la rodopsina. I ligandi che possono attivare i recettori sono diversi (NB.: recettori: diversi nelle porzioni amino e carbossi-terminale, simili nelle porzioni transmembranarie) e lo fanno in siti differenti. Le proteine sono chiamate G perché legano i nucleotidi guanilici.

Sono eterotrimeriche (subunità α, β, di ciascuno diverse isoforme), esistono anche alcune monomeriche come Ras, Rab (coinvolte nel traffico cellulare). β e γ, inizialmente pensate solo come supporto, sono associate a formare un complesso β-γ, sono idrofobiche e ancorate alla superficie citoplasmatica della membrana.

Gli effettori (attivati o inibiti dalle G protein) sono enzimi (adenilato ciclasi, fosfodiesterasi, fosfolipasi A2…) o canali ionici (spesso per il calcio e potassio NB.: Go (scoperta in oppiodi) chiude il canale per il calcio portando contrazione muscolare e secrezione, quindi comunicazione sinaptica).

Arrivato il ligando il recettore va incontro ad una modificazione conformazionale che lo rende capace di interagire con la subunità α della proteina eterotrimerica. La sub α subisce ora una modificazione conformazionale. La sub α a riposo lega GDP, dopo la modificazione perde affinità per il GDP e acquisisce affinità per il GTP (NB.: Non ha attività chinasica la sub α, è solo un problema di affinità). α con GTP legato subisce una modificazione conformazionale e perde affinità per le sub β e γ. A questo punto α può attivare i suoi effettori come l’enzima adenilato ciclasi che produce cAMP.

NB.: Meccanismi di accensione e spegnimento fisiologico sono necessari nei processi biologici. Spesso la malattia è la conseguenza di mancanza di inibizione, di spegnimento. α ha attività enzimatica GTPasica endogena che dopo tot secondi scambia GTP con GDP e ritorna affine per β e γ.

Es.: Pertosse: a causa di un’ADP-ribosilazione della proteina Gαi/o il GDP rimane legato alla proteina G si ha la continua attivazione di adenilato ciclasi aumento cAMP secrezione di muco.

Colera: a livello intestinale è bloccata l’attività GTPasica. Le enterotossine ADP-ribosilano la subunità αs non può idrolizzare GTP permanendo in uno stato “attivo” provoca l’attivazione continua di adenilato ciclasi e l’aumento di cAMP perdita di elettroliti e acqua.

Il recettore può anche essere desensitizzato o down-regolato, si può agire su secondi messaggeri. I recettori per neurotrasmettitori sono accoppiati a G protein: per le catecolammine, adrenergici, per la serotonina, per l’acetilcolina (muscarinici), per ormoni, per eicosanoidi, per fotoni. Le tre subunità hanno diverse isoforme.

In base alla subunità α si ha: proteina αs (stimolatoria su adenilato ciclasi), αi (inibitoria su adenilato ciclasi), αq (attiva la fosfolipasi c cascata fosfoinositidi di membrana), αo (accoppiata a canali per il calcio che chiude e per il potassio che apre). Anche le subunità β e gamma hanno diverse isoforme.

= Farmaco che mima l’azione di un ligando endogeno ❖ Agonista

Trasduttori: cAMP

L’attivazione dell’adenilato ciclasi da parte della subunità α porta una modificazione conformazionale sull’enzima il quale trasforma l’ATP (già legato all’adenilato ciclasi) in cAMP. L’cAMP può per esempio attivare o interferire con canali, modificarne la permeabilità, oppure agire su enzimi.

La chinasi PKA, cAMP dipendente, è un tetramero costituito da due subunità R regolatorie e due C catalitiche. Le sub R hanno ciascuna due siti per cAMP che, legato, permette il loro distacco dalle C che vanno a fosforilare in serina e treonina i loro specifici substrati.

NB.: La cellula finemente regola la produzione dei suoi secondi messaggeri che sono prodotti in seguito a stimoli derivanti dall’esterno. La concentrazione intracellulare di cAMP è regolata dall’adenilato ciclasi che può essere attivato o inibito (subunità αs o i). La regolazione della cAMP è determinata dalle fosfodiesterasi (12 isoforme dove alcune hanno sotto-isoforme per varianti di splicing. Hanno espressione cellulo-specifica.), queste deciclizzano e quindi inibiscono l’cAMP.

Trasduttori: fosfolipidi di membrana

Il PIP2 è un fosfolipide di membrana su cui agisce la fosfolipasi Cβ, attivata dalla Gq. Il PIP2 viene scisso in IP3 e DAG. Il DAG rimane nella membrana plasmatica ma diventa un attivatore della PKC che fosforila substrati come canali, trasportatori…

IP3 è una molecola estremamente idrosolubile che può viaggiare nel citoplasma. Sul reticolo endoplasmico ha un suo recettore che si apre in seguito al legame e, essendo ricco di calcio (posto dalle calcio ATPasi presenti sulla membrana plasmatica e sul RE), lo libera nel citosol e aumenta il calcio intracellulare.

NB.: Nel RE ci sono le proteine buffer calsequestrina, calreticulina ad alta capacità e bassa affinità per il calcio. A volte anche β e γ possono essere trasduttori a livello cardiaco i recettori M2 attivati da G proteine sono in grado di aprire i canali per il potassio che esce dalla cellula che si iperpolarizza.

La fosfolipasi C può essere attivata da una via indipendente da recettori accoppiati a G protein (Gq):

Recettori con attività tirosin chinasica intrinseca

Recettori monomerici (non funzionano come monomeri). Ne sono stati identificati oltre 50 suddivisi in 10 sottoclassi. Il legame con il ligando causa dimerizzazione attività enzimatica tirosin chinasica attiva.

Struttura:

• Dominio di binding del ligando extracellulare
• Singolo dominio transmembrana
• Dominio tirosin chinasico citoplasmatico
• Domini regolatorio

Si hanno transfosforilazioni in tirosina che sono segnali per proteine con domini SH2 e SH3, sequenze consensus che permettono di riconoscere le tirosine fosforilate e quindi il recettore. Normalmente il meccanismo di trasduzione del segnale porta l’attivazione della cascata delle MAP chinasi.

Tramite dominio SH2 Grb2 lega i siti transfosforilati. Grb2 è un adattatore, lega Sos (Son of sevenless) che è una GEF (guanidine nucleotide exchange factors), uno scambiatore di GDP-GTP su Ras. Ras con GTP può interagire fisicamente con Raf. GAP (GTPase activating proteins, opposto di una GEF) riscambia GTP con GDP su Ras. Si attivano le MAPK che attraverso ERK vanno nel nucleo e inducono mitosi, apoptosi, differenziazione, motilità...

Anche la fosfolipasi C gamma (NB.: Non ha sito di interazione con α Gq) ha domini SH2 e SH3. Può portare un aumento di calcio intracellulare sfruttando una via diversa da quella di Gαq. Si può ad esempio sfruttare la via di un recettore per fattore di crescita.