Cromatografia

PURIFICAZIONE DI PROTEINE

La puri cazione delle proteine serve per ottenere una proteina il più possibile pura, in modo

da poter studiare in laboratorio le sue caratteristiche chimico- siche, la sua struttura e le sue

funzioni biologiche. La puri cazione è possibile perché proteine diverse hanno proprietà

diverse, per esempio per quanto riguarda la carica, la dimensione e la solubilità. Sfruttando

queste differenze possiamo separare la proteina che ci interessa dalle altre proteine e dalle

altre sostanze presenti nelle cellule. In generale, si parte dall’estrazione della proteina, poi si

fanno delle prime separazioni, successivamente si utilizzano tecniche come la cromatogra a

e in ne l’elettroforesi per controllare il grado di purezza.

La proteina può essere ottenuta da diverse fonti biologiche, come batteri, lieviti, cellule o

tessuti animali e vegetali. La strategia di puri cazione dipende dal tipo di proteina, da dove

si trova nella cellula, dalla quantità che vogliamo ottenere e dal tipo di studio che dobbiamo

fare. Se la proteina è extracellulare, cioè si trova fuori dalla cellula o viene secreta nel

terreno di coltura, non è necessario rompere le cellule e la proteina può essere recuperata dal

liquido attraverso centrifugazione o ltrazione. Se invece la proteina è intracellulare,

bisogna rompere le cellule per liberarla.

La rottura delle cellule si chiama lisi cellulare e permette di ottenere un estratto grezzo, cioè

una miscela che contiene la proteina che ci interessa insieme ad altre proteine, frammenti di

membrana e altre sostanze cellulari. La lisi deve essere effettuata in un tampone adatto, che

deve mantenere la proteina nella sua forma naturale, cioè nella sua struttura nativa. Il

tampone deve avere un pH adatto e può contenere anche degli inibitori delle proteasi, che

servono a evitare che le proteine vengano degradate.

La lisi può essere effettuata con metodi non meccanici oppure meccanici. Tra i metodi non

meccanici troviamo lo shock osmotico, utilizzato soprattutto per cellule fragili, lo shock

termico, che consiste in cicli di congelamento e scongelamento, e gli enzimi litici, che

danneggiano la parete cellulare, per esempio nei lieviti. Tra i metodi meccanici troviamo

invece l’omogeneizzazione, l’estrusione ad alta pressione, l’estrusione di cellule congelate e

la sonicazione, che utilizza onde ultrasoniche per rompere le cellule. Durante i metodi

meccanici bisogna lavorare a bassa temperatura, generalmente intorno ai 4 °C, perché il

calore prodotto può denaturare e quindi danneggiare le proteine.

Dopo la lisi si può utilizzare la centrifugazione, che permette di separare le diverse

componenti. La parte che si deposita sul fondo viene chiamata pellet, mentre la parte liquida

che rimane sopra viene chiamata surnatante. A seconda di dove si trova la proteina che ci

interessa, possiamo recuperare il pellet oppure il surnatante.

Una volta ottenuto l’estratto grezzo, si può fare una prima puri cazione attraverso la

precipitazione frazionata. Questa tecnica sfrutta la diversa solubilità delle proteine e

permette di eliminare parte delle sostanze presenti nel campione. L’obiettivo è ottenere una

miscela più semplice e con un volume minore, che potrà essere puri cata meglio nelle fasi

successive.

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Un primo metodo è la precipitazione al punto isoelettrico. Le proteine possono avere una

carica positiva o negativa a seconda del pH della soluzione. Ogni proteina ha un punto

isoelettrico, o pI, cioè il pH al quale la sua carica netta è uguale a zero. Quando il pH

raggiunge il pI, la solubilità della proteina è minima e le proteine tendono ad aggregarsi e a

precipitare. Questo processo è reversibile, perché modi cando di nuovo il pH la proteina

può tornare in soluzione.

Un altro metodo è la precipitazione con i sali, chiamata salting in e salting out. Si possono

utilizzare, per esempio, il cloruro di sodio o il solfato di ammonio. Con il salting in, quando

si aggiunge una piccola quantità di sale, la solubilità della proteina può aumentare.

Aumentando ulteriormente la concentrazione di sale si può invece avere il salting out, cioè

una diminuzione della solubilità e la conseguente precipitazione della proteina. Proteine

diverse precipitano a concentrazioni diverse di sale, quindi questo fenomeno può essere

sfruttato per separarle.

Il processo del salting out può essere invertito attraverso la dialisi. La dialisi utilizza una

membrana con pori molto piccoli che permette alle molecole piccole, come i sali, di

attraversarla, mentre le proteine, essendo più grandi, rimangono all’interno. In questo modo

il sale viene progressivamente eliminato e la proteina può tornare in soluzione.

Esistono anche metodi di precipitazione che possono causare la denaturazione delle

proteine. Uno di questi è la precipitazione con il calore. Il calore fa perdere alla proteina la

sua struttura naturale e può esporre le parti idrofobiche che normalmente si trovano

all’interno della proteina. Queste parti tendono ad aggregarsi tra loro e la proteina precipita.

Questo processo è generalmente irreversibile.

Un altro metodo è la precipitazione con solventi organici, come etanolo e acetone. Questi

solventi competono con le proteine per le molecole d’acqua e riducono la loro solub