Crocette e domande aperte strutture di Strutture bioartificiali e biomimetiche

Domande strutture

1. (02/2023) Rigenerazione muscolare: materiale; tecnica di fabbricazione; caratterizzazione meccanica, morfologica, biologica in vitro

Per la rigenerazione di un muscolo è necessario ingegnerizzare un biomateriale con determinate caratteristiche meccaniche equiparabili a quelle del muscolo, presentare velocità di biodegradazione tale per cui viene sostituito da tessuto neoformato, e presentare una struttura ordinata e gerarchica.

Un possibile approccio potrebbe essere il bioprinting di idrogelo in GelMA su una matrice elettrofilata in PLLA. Questo blend fornisce resistenza meccanica (PLLA) e adesione cellulare (GelMA).

L’elettrospinning del PLLA va svolto con collettori piani per ottenere delle fibre allineate (biomimare la struttura ordinata del muscolo). Essendo la GelMA thermo-responsive, è necessario modulare correttamente le temperature di ugello (> 32 °C) e collettore (< 32 °C) sia per la stampa che per la vitalità cellulare. Dopo lo stampaggio la GelMA va reticolata tramite raggio UV (non tossico).

Caratterizzazione morfologica tramite SEM per studiare l’allineamento e il diametro delle fibre, (se le scanalature sono strette la cellula sarà più propensa a seguire quella direzione).

Prove cellulari in vitro con microscopio ottico e immunofluorescenza per valutare la vitalità cellulare e l’orientamento delle cellule. Uso cellule di linea non primarie in quanto più lente, dipendono fortemente dal paziente e potrebbero non allinearsi.

Valutazione meccanica tramite prove a trazione, stress relaxation e recovery (deformazione al 10%) con prove a carico ciclico per calcolare i tempi di degradazione e il grado di reticolazione.

Valutazione citotossica in quanto per la stampa di PLLA sono stati utilizzati dei solventi.

2. Rigenerazione del tessuto muscolare: scaffold, caratterizzazione, vantaggi dell’utilizzo dei poliuretani

È possibile utilizzare la tecnica di elettrospinning: consente la produzione di scaffold nanostrutturati in PCU (buon elastomero) che mimino la ECM naturale. I parametri di processo devono essere ben definiti e riguardano l’orientamento delle fibre (random-aligned), la concentrazione del polimero e NaCl, la percentuale di DMF e cloroformio.

Tramite un collettore è possibile ottenere fibre allineate su film liscio o su matrice random: un collettore parallelo fornisce fibre che si orientano nel gap tra le due piastre, un collettore rotante di grandi dimensioni fornisce fibre orientate in modo ordinato da cui si ricavano matrici piane, un collettore a disco fornisce strutture orientate di piccole dimensioni.

Per valutare le varie tipologie di substrati si utilizzano hASCs coltivate in DMEM con 10% FBS. Si valuta il differenziamento miogenico e le cellule vengono osservate con SEM e microscopio a fluorescenza.

L’analisi a fluorescenza fa uso di anticorpo di topo monoclonale anti-miosina e anticorpo secondario FITC per valutare la fast skeletal miosina e tropomiosina, FITC-phalloidin evidenza l’actina, mentre Hoechst contiene dei marker per nuclei. A sette giorni dalla confluenza si analizza l’espressione della miosina e della tropomiosina: per PCU liscio con fibre allineate l’espressione è bassa, per PCU random con fibre allineate si ha invece buona espressione della miosina e della tropomiosina. Dall’analisi SEM si nota miglior allineamento e formazione di miotubi nel caso di PCU con film random e fibre allineate.

3. Rigenerazione tessuto adiposo: materiali, metodi, caratterizzazione morfologica e meccanica ed eventuale funzionalizzazione dello scaffold

Perché per questa rigenerazione la gelatina reticolata è migliore del PU espanso? Metodo per reticolare la gelatina e come verifichi l’avvenuta reticolazione.

Per la rigenerazione del tessuto adiposo si potrebbe pensare ad uno scaffold di gelatina reticolata UV, stampata con una tecnica di bioprinting, inglobando adipociti. Impostiamo la cartuccia ad una temperatura superiore alla UCST della gelatina (T > 37 °C) e il piatto di stampa ad una temperatura inferiore alla UCST (T = 20 °C). Si aggiunge un fotoiniziatore in soluzione per permettere la reticolazione con raggio UV dopo l’estrusione.

La caratterizzazione parte da prove di variazione ponderale per valutare la stabilità. Poi, è possibile fare prove meccaniche a compressione. Per valutare le proprietà biologiche si fanno frequency sweep tests. Per valutare citocompatibilità e differenziamento adipogenico in vitro gli scaffold sono stati seminati anidri con preadipociti, poi posti in mezzo di coltura adipogenico o di mantenimento. L’attività metabolica è stata valutata con saggio Alamar Blue, mentre la valutazione delle cellule vitali è avvenuta con LIVE/DEAD staining prima di indurre il differenziamento. Per valutare il differenziamento adipogenico si usa Oil Red O staining.

Il PU espanso è una schiuma poliuretanica e quindi ha maggiore porosità, che implica minori proprietà meccaniche, riscontrabili mediante prove a compressione.

Per la vascolarizzazione dello scaffold è possibile utilizzare strutture sacrificali per produrre canali pervi.

Partendo dall’idrogelo di gelatina reticolata con microsfere di alginato per ottenere macropori nell’idrogelo, si stampa in 3D l’alginato con geometria desiderata, poi si ricopre con un secondo strato di gelatina reticolata con microsfere di alginato. Infine, si rimuovono selettivamente le microsfere e l’alginato stampato tramite chelanti di ioni Ca²⁺.

4. (Simulazione 2022) (02/2023) Scaffold 3D a base di fibroina della seta per lo studio in vitro di patologie tumorali a carico del tessuto adiposo

Dovete realizzare uno scaffold 3D a base di fibroina della seta per lo studio in vitro di patologie tumorali a carico del tessuto adiposo. Lo scaffold deve avere caratteristiche meccaniche adeguate a mimare il tessuto (E = 10-30 kPa) e, allo stesso tempo, promuovere la neo-vascolarizzazione fino al cuore dello scaffold.

• A. Descrivere, giustificando le vostre scelte, come procedereste per la realizzazione dello scaffold a base di fibroina della seta (potete, se lo ritenete necessario, fare blend con altri materiali, giustificando la vostra scelta).
• B. Spiegare, giustificando le vostre scelte, come procedereste all’ottenimento di una rete vascolare all’interno dello scaffold realizzato.
• C. Descrivere come procedereste alla caratterizzazione fisico-meccanica dello scaffold con e senza la rete vascolare. Motivate la vostra risposta. Riportare due grafici della caratterizzazione svolta (uno per la caratterizzazione fisica e uno per la caratterizzazione meccanica).
• D. Descrivere come procedereste per lo svolgimento di una prova di citocompatibilità diretta in vitro dello scaffold con e senza la rete vascolare. Riportare un grafico di un risultato ottenibile dalla caratterizzazione svolta.

A. Possiamo fare un blend della fibroina con il policaprolattone (PCL), perché conferisce una struttura più flessibile e lavorabile al copolimero (andrebbe reticolato per poterlo usare, bisogna stare attenti al grado di reticolazione). Il blend va fatto con un materiale più flessibile. Per la formazione dello scaffold si usa freeze-drying perché può essere usata anche con materiali naturali e usiamo solventi diversi per creare una doppia porosità (non è necessario, ma migliora la diffusione nei nutrienti).

B. Per la vascolarizzazione, siccome lo scaffold è già formato, utilizzerei i bioreattori così da perfondere lo scaffold con sospensione cellulare in una direzione, stimolando la formazione di vasi.

C. La caratterizzazione parte da prove di variazione ponderale per valutare la stabilità. Poi prove meccaniche a compressione (per verificare che il modulo elastico sia paragonabile a quello del tessuto adiposo). Si nota la risposta viscoelastica tipica dei soft tissues, con proprietà meccaniche che dipendono dallo swelling. Per valutare le proprietà biologiche si fanno frequency sweep tests.

D. Per valutare citocompatibilità e differenziamento adipogenico in vitro gli scaffold sono stati seminati anidri con preadipociti, poi posti in mezzo di coltura adipogenico o di mantenimento. L’attività metabolica è stata valutata con saggio Alamar Blue, mentre la valutazione delle cellule vitali è avvenuta con LIVE/DEAD staining prima di indurre il differenziamento. Per valutare il differenziamento adipogenico si usa Oil Red O staining.

5. Rigenerazione di tessuti vascolari di piccolo calibro in fibroina di seta: motivi della non idoneità; scelta di un materiale e di una tecnica in sostituzione; resa biomimetica, modifiche di superficie; caratterizzazione totale dello scaffold

I principali limiti della rigenerazione di tessuti vascolari di piccolo calibro in fibroina della seta sono:

• A. La parete del vaso non è differenziata nelle varie tuniche;
• B. A seguito della sgommatura e del bagno in LiBr la fibroina è del tipo silk I, per renderla silk II è necessario effettuare il dipping in metanolo. Se dovessero rimanere dei residui di metanolo quest’ultimo è tossico per le cellule e potrebbe compromettere la loro vitalità;
• C. È un materiale non riconosciuto come self dall’organismo possibile risposta infiammatoria.

La fibroina da sola potrebbe non essere adatta per la rigenerazione dei vasi di piccolo calibro perché non adesiva per le cellule. In alternativa, potremmo fare uno scaffold in PLA elettrofilato, con l’aggiunta di fibrina. Così da avere buone proprietà meccaniche (in particolare compliance) e buone proprietà di proliferazione cellulare. La fibrina potrebbe essere stampata con una tecnica di bioprinting così da poter inglobare le cellule nel costrutto. In particolare, utilizzando la fibrina come coating il costrutto risulterebbe self per l’organismo e inoltre è un materiale che promuove l’adesione cellulare.

Caratterizzazione:

• Morfologica: SEM per vedere la riuscita in generale del costrutto (porosità e diametro fibre).
• Biologica.
• Citocompatibilità diretta: analizzo vitalità cellulare dopo la tecnica di bioprinting (Alamar Blue).
• Citotossicità: per verificare l’avvenuta evaporazione del solvente nell’elettrospinning.
• Meccaniche: prova a trazione uniassiale.
• Prove circonferenziali.
• Prove di compliance.
• Studio della degradazione: soluzione fisiologica, peso molecolare nel tempo.

6. Foglietti cellulari: materiale sintetico per sostituzione (Cell sheet engineering con materiale sintetico)

Il cell sheet engineering permette d’ottenere tessuti a partire dalle cellule, senza l’utilizzo di scaffold, sfruttando la capacità delle cellule di sintetizzare la matrice del tessuto senza l’uso di scaffold. Nel self-organization vengono messe in un pozzetto di coltura le cellule e fatte aderire, formando un foglietto.

Come materiale sintetico potremmo utilizzare il pNIPAAm come materiale per il substrato, sfruttando così le sue proprietà T-responsive. È un materiale LCST con T a 32 °C, quindi avrà una transizione critica sol-gel con l’aumentare della T, quando abbiamo T > 32 °C il materiale si trova in uno stato di gel in cui è idrofobico, per una T < 32 °C abbiamo un’idratazione delle catene e uno stato di sol in cui è idrofilico che favoriscono il distaccamento del foglietto cellulare.

Si esegue una coltura a 37 °C nel pozzetto ricoperto di pNIPAAm, una volta formato il foglietto cellulare si abbassa la temperatura e si pone uno strato di gelatina sopra per evitare troppi stress meccanici alle cellule. A questo punto il pNIPAAm passa da idrofobico a idrofilico e permetterà il distaccamento del foglietto cellulare. Il foglietto viene posto in un altro pozzetto di coltura, viene nuovamente alzata la temperatura a 37 °C e si stacca il foglietto di gelatina. In alternativa, sempre andando ad abbassare prima la temperatura, si può aspirare il foglietto cellulare formato del pozzetto di coltura ricoperto di pNIPAAm con una pipetta per poterlo spostare in un altro pozzetto o nel luogo di interesse.

Le temperature operative dovranno essere compatibili con la vitalità cellulare per la buona riuscita della produzione del foglietto cellulare.

7. Ottenimento di foglietti cellulari con forma ad anello: materiale, motivazione, tecnica per ottenere lo scaffold, eventuali modifiche apportate, test di caratterizzazione con gli output che ne derivano

(Impiego della metilcellulosa nella cell sheet engineering (caratteristiche termo-responsive)).

La metilcellulosa è un materiale intelligente con caratteristiche thermo-responsive, possiede infatti una LCST: per alte temperature il materiale è allo stato gel-like con caratteristiche idrofobiche, per basse temperature è allo stato liquid-like con caratteristiche idrofiliche. La LCST della metilcellulosa è però molto alta, intorno ai 60 °C, e per abbassarla sotto i 37 °C è necessario diminuire la concentrazione di metilcellulosa oppure utilizzare dei particolari sali in particolari concentrazioni.

Nella cell sheet engineering può essere utilizzata nella self-organization come substrato che cambia le proprietà a seguito di uno stimolo termico. Si utilizza una piastra di coltura ricoperta da uno strato di metilcellulosa a 37 °C (stato idrofobico adesivo per le cellule) e si seminano le cellule che formano un foglietto cellulare adeso al substrato. Quando il foglietto è formato si abbassa la T intorno ai 20 °C e il substrato diventando idrofilico permette il distacco del foglietto.

Es. di caratterizzazione biologica in vitro: si usano linee cellulari diverse, fibroblasti murini modificati per l’espressione della GFP e cellule endoteliali murine (MS1). I test di citotossicità indiretta non mostrano effetti sulle cellule. I test di citocompatibilità diretta si basano su un coating di collagene di tipo I, con semina cellulare di 1,5*10⁵ cellule/pozzetto e coltura per 48 ore a 37 °C e 5% CO₂.

Si fa un saggio di vitalità cellulare Alamar Blue. Si nota un incremento di vitalità fra 24 e 48 ore, valori di RFLU dei campioni bulk superiori a quelli dei campioni ring per la diversa area superficiale disponibile. Tramite una successiva analisi si va a valutare la dimensione in base a quella attesa, valori effettivi minori dimostrano l’avvenimento del fenomeno di shrinkage. Tramite immunofluorescenza è possibile valutare la struttura microscopica dei foglietti: si hanno foglietti compatti, cellule coese senza orientamento cellulare evidente, forma d’anello con cellule orientate in direzione circonferenziale.

Dopo il distacco dei foglietti si valutano adesione e proliferazione su nuovo substrato.

Al termine i foglietti restano adesi al fondo del pozzetto, con adesività garantita dalle proteine della ECM mantenuta integra. Le cellule migrano fuori dal foglietto e colonizzano il pozzetto, dimostrando alta vitalità cellulare a seguito del distacco.

8. Cell sheet engineering: metodi di ottenimento di strutture tubolari con il self assembly

La tecnica self assembly è usata nella cell sheet engineering, cioè quando si vuole realizzare uno scaffold o un costrutto assemblando cellule in modo spontaneo, facendole tendere alla configurazione di minima energia senza l’ausilio di stimoli dall’esterno, ovvero senza un substrato su cui farle aderire.

Per ottenere strutture tubolari vengono prima ottenuti dei foglietti cellulari in stampi non adesivi per le cellule, questi foglietti vengono poi arrotolati su se stessi per andare a formare le strutture tubolari.

Si può ottenere una struttura tubolare formata da un solo foglietto arrotolato su se stesso, ma in questo caso non si riuscirebbe a mimare in maniera efficiente la parete del vaso composta da più strati con diverse cellule. Esistono due possibili opzioni:

• Arrotolare un foglietto di cellule muscolari lisce e sopra arrotolargli un foglietto di fibroblasti. Vi è il rischio di ottenere pareti troppo spesse.
• Effettuare una co-coltura di cellule muscolari lisce e fibroblasti per ottenere entrambi i fenotipi cellulari sullo stesso foglietto. Si può procedere andando ad arrotolare il foglietto su se stesso ottenendo la struttura tubolare con all’interno le cellule muscolari lisce e all’esterno fibroblasti.

Un altro metodo per ottenere strutture tubolari per self-assembly è ottenere dei ring di cellule auto-aggregate (TEVGs) in appositi stampi di agarosio ed andare poi ad impilare i ring che, essendo dello stesso fenotipo cellulare, andranno a fondersi gli uni sugli altri formando il complesso tubolare.

9. Metodi di stampa per la metilcellulosa: scelta di un tipo di stampa con metodo e caratterizzazione

La metilcellulosa può essere stampata con tecniche di bioprinting, sfruttando la sua proprietà di risposta a stimoli di temperatura. Ha una LCST di 60 °C che per gli utilizzi biomedicali può essere abbassata a 20 °C, variando la concentrazione di metile o inserendo ioni salting-out in soluzione. Così da poter impostare nella cartuccia una temperatura inferiore alla LCST (T = 20 °C) e una temperatura maggiore della LCST nel piatto di stampa (T = 37 °C).

Come prove si può fare un test di citotossicità e di citocompatibilità per verificare che la presenza di sali per abbassare la LCST non vada ad influire sulla vitalità cellulare.

10. Parametri da valutare per la stampa di gelatina UV-reticolata

• Dimensione dell’ugello.
• Viscosità della soluzione polimerica (concentrazione).
• Distanza tra ugello e piattaforma.
• Velocità di estrusione.
• Pressione di estrusione (sforzo di taglio).
• Temperatura dell’ugello.
• Temperatura della piattaforma.
• “Time gelation” del polimero.
• Tempo di fabbricazione (per le cellule).
• (Tempo di volatilizzazione del solvente).

11. Come stamperesti la gelatina e cosa controlleresti

Alternative: Stampa di un idrogelo di gelatina reticolata: caratterizzazione reologica e grafico. Studio e analisi prima e dopo la stampa, prove.

La gelatina è un materiale naturale derivato dal collagene che per essere stabile necessita di essere